OLETF大鼠糖尿病肾病发生发展不同阶段视网膜的病理学改变及机制探讨

发布时间：2017-11-19 03:27

  本文关键词：OLETF大鼠糖尿病肾病发生发展不同阶段视网膜的病理学改变及机制探讨

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【摘要】：目的:糖尿病的并发症主要包括大血管及微血管并发症,其中常见的微血管并发症有糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)和糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)。目前DN已成为导致终末期肾病(endstage renal disease,ESRD)的第一位病因,且缺乏有效的治疗手段;而DR也已成为成人致盲的最主要原因之一。DN和DR的发病机制尚不完全清楚,但传统观点均认为高血糖及其异常代谢产物的形成是导致其血管损伤的病理基础,因此理论上,二者应该是平行发展的。有观点认为,糖尿病的微血管并发症可能在起病后的同一时间出现。因此临床上常把是否合并糖尿病视网膜病变作为DN的重要诊断依据之一。虽然多数研究都提示DN与DR的发病有一定相关性,但也并不完全平行。临床观察发现有些患者存在蛋白尿而无视网膜病变,或者有视网膜病变而无蛋白尿,亦或两者均存在,但彼此间的严重程度并不一致。另外,越来越多的研究提示,肾脏在糖耐量减低(impaired glucose tolerance,IGT)的糖尿病前期,即已出现不同程度的结构和功能改变。为了进一步观察糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变间的相关性,我们同步观察了OLETF大鼠糖尿病肾病发生发展不同阶段视网膜的病理学变化,并对其发病机制进行探讨。本研究以自发2型DM动物模型OLETF大鼠为研究对象,观察大鼠糖尿病肾病发生发展的各个时期:正常糖耐量(normal glucose tolerance,NGT)期、糖耐量减低(impaired glucose tolerance,IGT)期、DM期及DN期视网膜的病理学改变,并从炎症、缺血缺氧及血-视网膜屏障损伤等角度探讨糖尿病视网膜病变的发生机制,以期为糖尿病微血管并发症的早期防治提供理论参考。方法:1)SPF级雄性OLETF大鼠45只,高脂饲料喂养;LETO大鼠30只予普通饲料饮食。LETO大鼠作为OLETF大鼠的正常对照鼠,同系不同株,不发生DM。2)大鼠体重每周监测一次;空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)采用剪尾法测量;每2周留取24h尿检测24h尿微量白蛋白;每2周空腹尾静脉取血用于肾功能:尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,SCr)及血脂如总胆固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三酯(triglyeride,TG)、游离脂肪酸(freefattyacid,ffa)等的检测;血清中的白细胞介素-6(interleukin-6,il-6)及肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)应用酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)法检测。大鼠每4周做一次口服葡萄糖耐量试验(oralglucosetolerancetest,ogtt),糖负荷后血糖峰值16.8mmol/l,120min血糖值11.1mmol/l,二者满足其一则为igt期;两者均符合则为dm期;直至两组大鼠24huma含量出现统计学差异时则为dn期。3)于oletf大鼠糖尿病肾病发生发展的各个时期(ngt、igt、dm和dn期)随机处死6只大鼠,同时处死6只与其各个时期相对应的leto大鼠,并留取视网膜组织。采用光镜、透射电镜观察大鼠视网膜的病理学形态变化;免疫组化法及rt-pcr检测糖尿病肾病发生发展中视网膜组织hif-1α、inos、nf-κb、vegf、icam-1、mmp-9、occludin的表达,以探讨炎症、缺氧缺氧及brb损伤与糖尿病视网膜病变的关系。结果:1)ogtt结果及一般资料分析:oletf大鼠在8周龄时,其ogtt各个时间点的血糖值与同期leto大鼠相比均未见异常(p0.05),符合ngt期特点。在30周龄时,oletf大鼠除了fbg没有升高外,其余各个时间点的血糖值与同期leto大鼠相比均升高(p0.05),且高峰值为18.24±4.08mmol/l(大于16.8mmol/l),120min的血糖值为9.55±2.06mmol/l,符合igt特点。在56周龄及65周龄时,oletf大鼠在各个时间点的血糖值均比同期leto大鼠的血糖值高(p0.05),高峰值分别为18.61±3.93mmol/l、19.36±5.17mmol/l(均大于16.8mmol/l),120min的血糖值分别为13.25±6.72mmol/l、13.54±6.66mmol/l(均大于11.1mmol/l),符合dm期特点。oletf大鼠的体重、ffa、tg在igt期即已高于同期leto大鼠及ngt期oletf大鼠(p0.05);同样,tc在igt期也高于同期leto大鼠及ngt期oletf大鼠(p0.05)且在dn期进一步升高(p0.05)。fins虽然在igt期比同期leto大鼠及ngt期oletf大鼠(p0.05)高,但在dm期开始降低(p0.05),至dn期进一步降低(p0.05)。以上资料表明我们成功复制了2型糖尿病动物模型。2)24huma结果:oletf大鼠在ngt期其24huma与同期leto大鼠相比未见明显差异(p0.05);在igt及dm期24huma逐渐升高,但与同期leto大鼠相比差异均无统计学意义(p0.05);直至dn期其24huma与同期leto大鼠相比出现显著升高(p0.05)。24huma变化结果表明,我们成功复制了糖尿病肾病模型。3)oletf大鼠视网膜he结果:ngt期oletf大鼠与对照组间无明显变化;igt期oletf大鼠神经节细胞层间质水肿,内界膜表面不平、节细胞数量减少;dm期oletf大鼠视网膜除了节细胞层水肿外,内、外核层也出现水肿,且神经节细胞明显减少,颗粒层变薄、细胞稀疏排列紊乱,光感受器细胞层细胞结构紊乱;dn期oletf大鼠视网膜各层水肿,神经节细胞数量进一步减少,内核层变薄,并可见突破内界膜的新生血管及外丛状层异常的新生血管。4)oletf大鼠视网膜电镜结果:ngt期:oletf大鼠视网膜内核层、神经节细胞层、外核层及视网膜膜盘与对照组均无明显变化。igt期:oletf大鼠:(1)视网膜内核层:内核层细胞排列尚整齐,但出现细胞水肿;(2)神经节细胞层:神经节细胞形态异常,线粒体肿胀、嵴模糊、空泡样变;(3)视网膜外核层:外核层细胞排列出现不规则;(4)视网膜膜盘:膜盘模糊,出现断裂。dm期:oletf大鼠:(1)视网膜内核层:内核层细胞染色质分布不均,细胞膜模糊,细胞水肿,胞质出现空泡;(2)视网膜神经节细胞层:神经节细胞线粒体肿胀明显,细胞器减少,胞质空泡变性加重;(3)视网膜外核层:外核层排列紊乱,间隙变大;(4)视网膜膜盘:感光细胞可见膜盘间隙增宽,数量减少。dn期:oletf大鼠:(1)视网膜内核层:内核层细胞空泡变性进一步加重,胞核碎裂;(2)神经节细胞层:神经节细胞胞质空泡变性进一步加重,核膜模糊、胞核固缩;(3)视网膜外核层:外核层排列紊乱,间隙进一步变大,胞质空泡变性;(4)视网膜膜盘:感光细胞可见膜盘间隙进一步增宽、数量进一步减少。5)oletf大鼠视网膜血-视网膜屏障相关指标免疫组化表达:occludin:ngt期与正常对照leto大鼠的表达无明显差异,主要在视网膜富含血管的神经节细胞层、内核层及外核层表达;至igt期其在神经节细胞层血管细胞中的表达开始减少;dm及dn期表达减少更明显。6)oletf大鼠视网膜炎症相关指标免疫组化表达:(1)vegf:ngt期其主要在视网膜神经节细胞层表达;igt期视网膜内核层也开始高表达;dm期vegf在视网膜外核层也开始表达;至dn期其在各层表达量进一步增加,几乎视网膜全层均有阳性表达,即随着糖尿病病程的进展,vegf在视网膜的表达逐渐增高;(2)icam-1:早期其主要在视网膜神经节细胞层和内核层表达,随着糖尿病病程的进展,视网膜神经节细胞层及内核层表达逐渐增多,到后期外核层也有表达;(3)MMP-9:早期主要在视网膜内丛状层表达,随着糖尿病病程的进展,视网膜外丛状层也有表达,且表达量逐渐增多;(4)NF-κB:NGT期主要在视网膜神经节细胞层表达,IGT期内核层表达明显增多,DM期外核层也高表达,至DN期几乎视网膜全层均可见阳性表达。7)OLETF大鼠视网膜缺血缺氧相关指标表达:(1)HIF-1α:NGT期其主要在视网膜神经节细胞层胞浆表达,内核层也有少量表达;至IGT期内核层表达明显增多,随着糖尿病病程进展,外核层也有表达,甚至可看到HIF-1α由胞浆转移到胞核;(2)iNOS:早期主要在视网膜神经节细胞层表达,且iNOS表达在OLETF大鼠NGT、IGT期与正常对照LETO大鼠无明显差异,至DM期iNOS在内核层表达明显增多,至DN期几乎视网膜全层均有阳性表达。结论:1)成功复制了2型糖尿病模型。2)成功复制了2型糖尿病肾病动物模型。3)OLETF大鼠视网膜组织结构在糖尿病肾病发生发展不同阶段,其病理学表现不同,且随病程进展其组织结构损伤逐渐加重,早期主要以视网膜内层受损为主,尤其是神经节细胞层。4)OLETF大鼠早期即可出现视网膜形态学变化:IGT期即可观察到神经节细胞层出现间质水肿,神经节细胞数量减少。电镜下视网膜内核层、神经节细胞层出现水肿,膜盘模糊,出现断裂,但是外核层损伤不明显。5)高血糖导致的代谢异常,进一步诱导视网膜组织炎症反应及缺血、缺氧,并参与了DR的发生。6)血-视网膜屏障的损伤也参与了DR的发生、发展。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】

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本文编号：1202187