巨噬细胞极化在白塞病发病机制中作用的研究

发布时间：2017-11-23 20:25

  本文关键词：巨噬细胞极化在白塞病发病机制中作用的研究

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【摘要】：研究背景和目的：白塞病(BD)是一种累及全身多系统的慢性血管炎性疾病,发病机制尚未完全阐明,目前认为是遗传、感染、免疫和环境等多种因素共同作用的结果。固有免疫异常是BD发病机制中的重要因素,巨噬细胞是天然免疫的关键成员,巨噬细胞按照其表型和分泌的细胞因子可分为两大类,即经典活化型巨噬细胞(M1型)和替代活化型巨噬细胞(M2型)。但目前BD发病过程中巨噬细胞极化的类型、作用和机制未明。本研究的目的是揭示初治活动BD患者血清对巨噬细胞表型和功能的影响,为探索新型治疗靶点提供理论依据。研究方法：1. ELISA检测30名初治活动BD血清和健康人血清中细胞因子IL10, IL6, IL8, TNFα和IFNΥ水平差异。2.人单核细胞来源巨噬细胞制备：Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs), CD14磁珠阳性分选单核细胞后,培养人单核细胞来源巨噬细胞(M0)。3.巨噬细胞极化标准亚型的建立：分别以IFN-Υ/LPS和IL4刺激M0巨噬细胞48小时,诱导标准M1和M2型巨噬细胞,流式细胞仪测定巨噬细胞表面标记CD86、CD163和CD206, ELISA检测培养液上清细胞因子TNF-a和IL12,作为标准对照。4.检测BD患者和HC血清对巨噬细胞极化表型的影响：收集14名初治活动BD患者血清和14名姓名年龄匹配的健康志愿者血清,以1/10体积血清诱导巨噬细胞极化并根据标准分型的表面标记和分泌细胞因子鉴定其表型。5.BD血清诱导的巨噬细胞极化的功能改变：流式细胞仪检测不同巨噬细胞分型的吞噬功能；通过巨噬细胞与Naive CD4+T细胞共培养,流式细胞仪检测胞内细胞因子IFNΥ和IL17A的表达,以测定不同巨噬细胞分型对Thl/17增殖分化的影响。6.BD血清诱导巨噬细胞极化的可能分子机制探讨：Western Blot检测初治活动BD患者血清刺激巨噬细胞不同时间后(p/T) STAT1和(p/T)NF-KBp65的蛋白水平,探索巨噬细胞极化的分子机制。结果：1.与健康人血清相比,初治活动BD患者血清中细胞因子TNFα[BD 10.24pg/ml(0-93.5) vs HC 3.29pg/ml (0-10.67),p0.001], IFN y [BD 5.39pg/ml (0-57.89) vs HC 1.27pg/ml (0-12.31), p=0.029]、 IL8 [BD 22.28pg/ml (4.72-82.43) vs HC 3.29pg/ml (0-6.53),p0.001]和IL6 [BD 1O.Opg/ml (2.0-39.9) vs HC 2.09pg/ml (0-5.41),p0.001]水平均显著增高,而IL10水平无明显差异[BD 2.41pg/ml (0-27.21) vs HC 3.57pg/ml (0-60.21),p=0.172]。 BD患者血清IL-6水平与ESR之间呈明显正相关(r=0.61,p=0.012),IL6水平与hCRP (r=0.626,p=0.009), L-8水平与hCRP (r=0.65,p=0.005), IL-10水平与hCRP均具有明显相关性(r=0.446,p=0.013),余细胞因子与ESR或hCRP无相关性。BD患者血清IL-6, IL-8, IL-10, TNFα和IFNΥ水平与BDCAF2006评分均无相关性。2.与M0巨噬细胞相比,初治活动BD血清可诱导的巨噬细胞分化为M1样巨噬细胞,表现为CD86表达增高(MBD 66.67 ± 15.85% vs MO 45.88 ± 9.75%, p=0.024),CD163表达降低(MBD 2.2 ± 1.57% vs MO 5.69 ± 2.43%, p=0.009),培养上清液中细胞因子IL12 [MBD 139.7 pg/ml (36.59-1038.17) vs MO 8.48 pg/ml (5.27-132.93),p=0.019]水平增高,TNF-a水平有增高趋势(MBD 205.6± 232.37 pg/ml vs MO 56.02 ±45.99 pg/ml, p=0.189),而HC血清诱导巨噬细胞符合M0巨噬细胞。3.与M0巨噬细胞相比,M1型巨噬细胞(Ml 51.38 ± 16.83% vs MO 27.03 ± 11.14%, p=0.014)和初治活动BD血清(MBD 50.53 ± 16.93% vs MO 27.03 ± 11.14%, p=0.011)均可诱导的巨噬细胞吞噬功能显著增加,HC诱导的巨噬细胞吞噬功能有增强趋势,但无统计学意义(MHC 39.26 ± 15.47% vs MO 27.03 ± 11.14%, p=0.134).4.与M0巨噬细胞相比,M1型巨噬细胞与Naive CD4+T细胞共培养后CD4+IFNγ+水平增高(Ml 19.5 ± 2.62% vs MO 11.78 ± 3.45%, p=0.037),同样,初治活动BD血清诱导的巨噬细胞与Naive CD4+T细胞共培养后T细胞CD4+IFNΥ表达亦有增高(MBD 18.5 ± 2.29% vs Mo 11.78 ± 3.45%, p=0.048),而HC诱导的巨噬细胞则不然(MBD 10.89 ± 3.8% vs Mo 11.89 ± 3.25%, p=0.745).5.与M0巨噬细胞相比,M1型巨噬细胞和初治活动BD血清诱导的巨噬细胞与Naive CD4+T细胞共培养后CD4+IL17A+水平增高,但尚未未达到统计型差异。6. LPS/IFNΥ和初治活动BD血清刺激巨噬细胞后,STAT1和NF-KBp65蛋白磷酸化水平均显著增加。结论：初治活动BD血清刺激巨噬细胞可诱导产生M1样巨噬细胞,并增强巨噬细胞吞噬功能,诱导T细胞向Thl为主的细胞增殖分化。BD血清中TNFa、 IFNΥ、 IL8和IL6水平高表达,可能通过激活JAK-STAT和NF-kB信号通路起作用。研究结果为揭示BD发病机制提供了新线索,为探索新型治疗靶点提供了一定的理论依据。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R597.9

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本文编号：1219722