托里消毒散对糖尿病创面血管生成的影响及机制研究

发布时间：2017-11-27 10:11

  本文关键词：托里消毒散对糖尿病创面血管生成的影响及机制研究

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【摘要】：目的本研究选用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)尾静脉注射和背部打孔法建立的糖尿病皮肤溃疡大鼠模型和人脑微血管周细胞为研究对象,采用全方干预及拆方(托法、透法)分治的方法对托里消毒散对糖尿病创面血管生成的影响及机制进行探讨。方法1.200只健康雄性SD大鼠,适应性喂养7d后随机分为两组,正常组40只,糖尿病组160只。糖尿病组大鼠禁食12h后予45mg/kg链脲佐菌素(STZ)(0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液稀释)尾静脉注射制备糖尿病模型,正常组大鼠尾静脉注射等体积的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液,以2次或2次以上随机血糖≥16.7mmol/L为糖尿病模型诱导成功,死亡及未成模的大鼠予以剔除。所有大鼠常规饲料喂养4周后苯巴比妥麻醉,利用直径1cm打孔器在背部打孔,制备皮肤溃疡动物模型,死亡及未成模的大鼠予以剔除。皮肤溃疡成模的糖尿病组大鼠随机分为四组:糖尿病组,糖尿病+托法组,糖尿病+透法组,糖尿病+全方组,皮肤溃疡成模的正常组大鼠即为对照组。糖尿病+全方组大鼠给予托里消毒散全方(当归1.5g/kg,黄芪1.5g/kg,白芷1.2g/kg,皂角刺1.2g/kg)灌胃,糖尿病+托法组大鼠给予托法方药(当归1.5g/kg,黄芪1.5g/kg)灌胃,糖尿病+透法组大鼠给予透法方药(白芷1.2g/kg,皂角刺1.2g/kg)灌胃,对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃,各组大鼠灌胃量控制在2ml左右,每天给药一次,连续给药14d。分别在创伤后5d、8d、11d、14d观察评价溃疡愈合状态,计算创面愈合率,并处死取溃疡组织备用。采用HE染色观察创面肉芽组织结构改变,应用RT-PCR法、Western Blotting法和免疫组织化学法检测当尿病大鼠溃疡组织中Ang-1、Ang-2和Tie-2的m RNA和蛋白的表达。2.体外培养人脑微血管周细胞(Human brain vascular pericyte,HBVP)和人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),用不同浓度的当归,黄芪,白芷,皂角刺提取物干预周细胞和内皮细胞,观察不同药物提取物对周细胞增殖,迁移,凋亡以及内皮细胞对周细胞的趋化作用的影响。结果1.体内实验1.1造模情况:糖尿病组160只大鼠中有8只大鼠未达到糖尿病成模标准,4只大鼠注射STZ后死亡,剔除实验,糖尿病成模率为148/160=92.5%;皮肤溃疡模型手术后至实验终点,各组大鼠死亡情况为,对照组死亡1只,糖尿病组死亡5只,糖尿病+托法组死亡3只,糖尿病+透法组死亡4只,糖尿病+全方组死亡3只。1.2各时间点各干预组愈合率均高于糖尿病组(P(27)0.05);创伤后5d,糖尿病+透法组愈合率高于糖尿病+托法组和糖尿病+全方组(P(27)0.05);创伤后8、11、14d,糖尿病+全方组愈合率高于糖尿病+托法组和糖尿病+透法组(P(27)0.05)。1.3糖尿病+全方组各时间点肉芽组织中Ang-1、Tie-2表达水平均高于糖尿病组,Ang-2表达水平均低于糖尿病组(P(27)0.05);创伤后5、8d,糖尿病+透法组Ang-2表达水平明显下调(P(27)0.05);创伤后11、14d,糖尿病+托法组Ang-1、Tie-2表达水平上调(P(27)0.05)。2体外实验2.1中药提取物对高糖条件下周细胞增殖的影响:高糖条件下,周细胞的增殖明显受抑制,不同浓度的当归、黄芪、白芷均能改善这一抑制作用(P(27)0.05),且在一定范围内呈剂量依赖性;皂角刺作用不明显。2.2中药提取物对高糖条件下周细胞迁移的影响:高糖条件下,周细胞的迁移明显受抑制,白芷能显著改善这一抑制作用(P(27)0.05),当归、黄芪、皂角刺作用均不明显。2.3中药提取物对高糖条件下周细胞凋亡的影响:Western blot显示,高糖条件下,周细胞Caspase3激活明显增加(P(27)0.05),黄芪可以明显抑制高糖条件下周细胞Caspase3的激活(P(27)0.05),抑制周细胞凋亡,当归、白芷、皂角刺效果不明显。RT-PCR显示,高糖条件下,抗凋亡蛋白bcl-2表达下降(P0.05),前调亡蛋白bax表达明显增加(P0.05),黄芪提取物可以显著降低高糖条件下周细胞bax m RNA的表达(P0.05),升高bcl-2 m RNA的表达(P0.05),抑制周细胞凋亡;当归、白芷、皂角刺干预组bax及bcl-2表达与高糖组无统计学差异。2.4体外共培养内皮细胞与周细胞显示,高糖条件下,内皮细胞对周细胞的趋化作用下降,当归、黄芪和白芷均能促进高糖条件下内皮细胞对周细胞的趋化作用(P0.05),皂角刺作用不明显。结论1.通过尾静脉注射STZ联合背部打孔法,成功制备糖尿病皮肤溃疡大鼠模型,且糖尿病大鼠创面愈合明显延迟。2.托里消毒散全方及拆方均能促进糖尿病皮肤溃疡大鼠的创面愈合,全方组效果最好。3.糖尿病组大鼠创面中Ang-1、Tie-2表达水平下降,Ang-2表达水平升高,导致创面新生血管成熟障碍,创面愈合受损;透法可以在创伤愈合的早期下调Ang-2的表达,托法可以在创伤愈合的晚期上调Ang-1、Tie-2的表达,从而促进新生血管成熟,促进糖尿病创面的愈合。4.成功在体外培养原代人脑微血管周细胞及人脐静脉内皮细胞;高糖条件下,周细胞的增殖,迁移受抑制,凋亡增加,内皮细胞对周细胞的趋化作用降低。5.托里消毒散四种中药提取物均可促进周细胞的增殖;此外,白芷可以明显促进周细胞的迁移;黄芪可以明显抑制周细胞的凋亡;当归,黄芪,白芷均可促进内皮细胞对周细胞的趋化作用。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2
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本文编号：1231483