自噬诱导和抑制对MIN6细胞株分化的作用初探

发布时间：2017-12-07 13:06

  本文关键词：自噬诱导和抑制对MIN6细胞株分化的作用初探

  更多相关文章： 糖尿病 自噬 ε/β细胞分化 Ghrelin Insulin mTOR Beclin1 Atg7 LC3 LAMP2 p62

【摘要】：背景和实验目的：糖尿病发病机制中有两个重要环节,就是胰岛p细胞分泌胰岛素不足和周围组织的胰岛素抵抗。如何促进胰岛p细胞的增殖、诱导p细胞再生并抑制p细胞凋亡是近年研究的热点。胰岛ε细胞与p细胞来源于共同的内分泌前体细胞,通过内源性机制保持分化的平衡。Ghrelin表达于ε细胞,insul in表达于p细胞。前期研究已发现宫内营养不良新生大鼠胰岛存在ε/p细胞分化失衡,其ε细胞数量和分布也与对照组显著不同,且上述ε/p细胞失衡与后期糖尿病风险密切相关。因此,明确ε/p分化失衡的机制有助于调控p细胞定向分化和增殖,是从发育早期干预和逆转糖尿病进程的重要切入点。新近的研究发现,自噬在调控ε/p分化、防止p细胞凋亡、维持p细胞数量及内环境稳定方面发挥极其重要的作用。自噬(autophagy)是细胞内形成的双层膜结构的自噬小体,包裹所降解的物质、大分子或细胞器,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬相关蛋白7(autophagy-related protein 7, Atg7)是维持成年干细胞多向分化性的重要调节因子；雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是细胞内营养状态的感受器,当细胞内营养丰富时,mTOR活化,通过抑制下游Atg蛋白,抑制自噬的发生；饥饿状态时mTOR活化被抑制,Atg家族成员活化,促进自噬体的形成。mTOR抑制因子及自噬活化因子能够显著提高诱导性多能干细胞产生的速度和效率；自噬也有助于维持处于分化终点的细胞稳态。基于以上背景,自噬可能在胰岛p细胞和ε细胞分化过程中发生作用,但具体机制尚不清楚。本研究拟用小鼠胰岛细胞瘤MIN6细胞株为模型,在体外培养,通过抑制或诱导剂调控自噬信号,在培养的不同阶段加入针对不同自噬阶段抑制剂或诱导剂,观察其对MIN6细胞株表达定向ghrelin分布和insulin的变化,以此推测其分化为ε/p细胞的潜能的变化,希望本结果可以为探索1型糖尿病的发生原因奠定基础。实验方法：利用小鼠胰岛素瘤MIN6细胞株,在培养的不同阶段加入针对不同自噬阶段的抑制剂或诱导剂,以PT-PCR、Western blot检测其对培养细胞自噬途径中关键因子LC3、Atg7、LAMP2、p62等表达的影响,同时以免疫荧光检测MN6细胞株表达ghrelin分布和insulin的变化,来探讨自噬对胰岛ε/p细胞分化的影响。实验结果：1.诱导／抑制自噬过程中几种自噬调控蛋白与效应蛋白的mRNA水平及蛋白水平进行检测发现,饥饿组细胞BECLIN1表达降低(P0.05),Atg7、LAMP-2基因表达增高,Lc3和P62基因未见明显改变；3-MA组细胞中BECLn,基因和Lc3基因表达降低(P0.05),其余基因未见明显的改变。Western-blotting对比检测抑制／诱导组与正常对照组中LC3与p62、LAMP2的水平,相对于对照组细胞,饥饿组细胞P62蛋白水平堆积(P0.05), Lc3-Ⅱ/Ⅰ表达降低(P0.05)；3-MA组细胞中P62水平未见明显变化,Lc3-Ⅱ/Ⅰ比例明显降低(P0.05)。LAMP-2蛋白在三组细胞中的表达未见明显变化。2. RT-PC R的结果同免疫荧光结果相一致,饥饿组细胞insulin基因的转录水平明显升高,3-MA组细胞insulin基因的转录水平则明显降低,饥饿组和3-MA组ghrelin基因的转录水平都显著降低。3.细胞分化实验的免疫荧光结果显示,同对照组细胞相比,饥饿组细胞分泌insulin的细胞比例明显升高,而3-MA组中分泌insulin的细胞比例则明显降低。同对照组相比,饥饿组和3-MA组分泌ghrelin的细胞比例都明显降低。结论：1.MIN6细胞株饥饿时出现insulin基因转录显著增加,ghrelin基因转录显著降低,提示ε/β失衡,从而说明ε/p细胞失衡与饥饿诱导有关；2.从自噬相关途径上的因子表达水平上,本实验中饥饿并没有诱导出自噬的发生。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1

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本文编号：1262473