脱氢表雄酮对人卵巢黄素化颗粒细胞及KGN细胞株凋亡作用的研究

发布时间：2017-12-13 21:22

  本文关键词：脱氢表雄酮对人卵巢黄素化颗粒细胞及KGN细胞株凋亡作用的研究

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【摘要】：目的：研究不同浓度DHEA对人卵巢颗粒细胞凋亡的影响。首先通过对原代人卵巢黄素化颗粒细胞的干预,观察细胞线粒体凋亡蛋白BCL-2^BAX及其mRNA的表达情况；再采用不同浓度DHEA干预KGN细胞株验证细胞的凋亡通路。探索雄激素对卵母细胞的影响。方法：1、培养正常卵巢储备功能患者卵巢黄素化颗粒细胞及其鉴定：收集2014年10月-12月在成都中医药大学第二附属医院生殖中心接受体外受精-胚胎移植(Invitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)或卵胞浆单精子显微注射(Oocyte intracellular single sperm injcetion, ICSI)治疗的25-30岁正常卵巢储备功能患者废弃的卵泡液,用40%Percoll分离液纯化细胞；通过FSHR进行颗粒细胞鉴定。2、DHEA对体外培养原代人卵巢黄素化颗粒细胞凋亡作用的研究：颗粒细胞培养48小时后加入不同浓度DHEA培养基,分为五组：阴性对照组、DHEA0.01μM组、DHEA0.1μM组、DHEA1pM组、DHEA10μM组,干预24小时,用Western blot检测BCL-2、BAX、ERK、P-ERK蛋白的表达,QPCR检测BCL-2 mRNA、 BAX mRNA的表达。3、DHEA对KGN细胞株凋亡作用的研究：①CCK-8检测DHEA对KGN细胞株的生长抑制作用,②流式细胞仪检测DHEA干预后的KGN细胞株凋亡情况；③ Western blot检测ERK、P-ERK、BCL-2、BAX、AR蛋白的表达,④ QPCR检测AR mRNA、BCL-2 mRNA、BAX mRNA的表达。结果：1、回收卵子后卵泡液中的颗粒细胞呈圆形,内含粗大的颗粒状物质,体外培养24小时后颗粒细胞已贴壁,并呈梭形改变。培养48小时,达细胞增殖高峰,细胞内颗粒物质丰富,伪足紧密连接。2、对体外培养48小时的人卵巢黄素化颗粒细胞加入DHEA干预后,BCL-2蛋白表达与阴性对照组相比有逐渐下降的趋势,BCL-2 mRNA表达也有下降的趋势,但差异无统计学意义；BAX蛋白及mRNA表达在对照组与干预组中的表达无明显差异。DHEA干预组ERK表达量与对照组相比无明显差异,P-ERK表达均明显低于对照组。3、与阴性对照组相比,不同浓度的DHEA对KGN细胞株的生长抑制作用均有明显差异(P0.05),其中DHEA10μM组对KGN细胞株生长的抑制作用最为显著(P0.01)。流式细胞仪检测细胞凋亡提示：随着DHEA浓度的增加,凋亡率增加,其中DHEAlOpM组凋亡率与阴性对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。BCL-2蛋白及mRNA的表达随着DHEA浓度的增加呈逐渐降低趋势,其中DHEA10μM组与阴性对照组相比差异有统计学意义(P0.05),而BAX、AR蛋白及mRNA的表达差异无统计学意义(P.05)。与阴性对照组相比,干预组P-ERK的表达均下降,其中DHEA10μM组与阴性对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。结论：1、本研究对收集的卵泡液中颗粒细胞进行分离纯化及鉴定,得到了纯度较高的颗粒细胞,证明试验中分离纯化的方法可行；2、不同浓度DHEA干预后均引起原代黄素化颗粒细胞BCL-2/BAX的下降,提示DHEA可通过线粒体凋亡途径诱导颗粒细胞凋亡；3、不同浓度的DHEA对KGN细胞株具有生长抑制及凋亡作用,可能与P-ERK-BCL-2凋亡通路相关,且不受雄激素受体(AR)的影响。本研究初步探讨DHEA对正常卵巢储备功能患者颗粒细胞的作用,为后续DHEA对卵巢低反应患者的研究奠定前期试验基础；为临床患者DHEA的应用提供试验基础。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R711.75

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1 田东梅;脱氢表雄酮对人卵巢黄素化颗粒细胞及KGN细胞株凋亡作用的研究[D];成都中医药大学;2016年

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本文编号：1286620