miR-32-5p在小鼠血管平滑肌细胞中对PTEN表达调控的作用及机制研究

发布时间：2017-12-18 13:40

  本文关键词：miR-32-5p在小鼠血管平滑肌细胞中对PTEN表达调控的作用及机制研究

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【摘要】：目的:本实验拟以小鼠血管平滑肌细胞为对象,探究miR-32-5p的靶向调控基因及其影响的细胞信号通路,为寻求血管钙化有效的潜在干预靶点提供实验依据。方法:1.通过在线核酸数据库获取miR-32-5p的成熟序列,利用靶基因预测软件并结合相关因素分析,筛选出miR-32-5p的靶基因。2.利用双荧光素酶报告基因载体,验证miR-32-5p与预测目标基因的靶向关系。3.构建miR-32-5p mimic/miR-32-5p inhibitor转染成功的小鼠血管平滑肌细胞并检验转染效率。4.利用实时荧光定量PCR及Western Blot技术分别检测miR-32-5p、预测目标基因mRNA及其蛋白的表达。5.采用Western Blot技术检测上调小鼠血管平滑肌细胞miR-32-5p后对靶蛋白的下游调控蛋白表达的影响。结果:1.利用miRanda、TargetScan、RNAhybrid等多个数据库,结合生物信息学和文献分析,发现PTEN为miR-32-5p的靶基因之一。2.转染miR-32-5p mimic的血管平滑肌细胞miR-32-5p表达水平明显上调,PTEN蛋白表达水平降低;而转染miR-32-5p inhibitor的血管平滑肌细胞miR-32-5p表达水平明显下调,PTEN蛋白水平显著上升。而miR-32-5p mimic或miR-32-5p inhibitor的转染对血管平滑肌细胞PTEN mRNA的表达水平没有显著影响。3.基因测序结果表明,野生型(WT)及突变型(MUT)PTEN 3’UTR荧光素酶报告基因载体构建成功,miR-32-5p mimic和WT-GV272-PTEN共转染组的荧光素酶活性显著下降,而miR-32-5p mimic和MUT-GV272-PTEN共转染组的荧光素酶活性无明显变化,对照质粒转染对野生型及突变型PTEN 3’UTR的荧光素酶活性均无影响。4.Western Blot技术检测显示转染miR-32-5p mimic组,PTEN调控下游P-AKT明显升高,RUNX2表示水平及RUNX2的磷酸化水平明显升高,PI3K抑制物LY294002可降低RUNX2及AKT与RUNX2的磷酸化水平,对PTEN蛋白的表达无明显影响。结论:1.miR-32-5p在小鼠血管平滑肌细胞中可通过靶向PTEN 3’UTR序列抑制PTEN的表达,PTEN是miR-32-5p下游的调控靶基因。2.miR-32-5p可通过靶向抑制PTEN的表达,进而激活PI3K/AKT通路,提高RUNX2及RUNX2的磷酸化水平,促进小鼠血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587

【参考文献】

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本文编号：1304389