miR-101靶向调节AMPK表达抑制高糖环境下肾小球系膜细胞自噬及促进其增殖
本文关键词：miR-101靶向调节AMPK表达抑制高糖环境下肾小球系膜细胞自噬及促进其增殖 出处：《南方医科大学》2016年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：[背景]糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是全球范围终末期肾脏病(End stage renal disease, ESRD)的最主要死亡原因之一,其患病率日益增加。根据中国肾脏数据系统提示,16.4%的DN患者发展为尿毒症,是国内尿毒症的第二发病原因,严重威胁人类健康。DN的发病机制复杂,至今尚未明确,而目前的治疗手段仅能延缓却未能阻断DN进展。因此,探索DN的发病机制,寻找新的治疗靶点,已成为当今医学领域研究的热点与难点。肾小球系膜细胞(Glomerular mesangial cells, GMCs)是肾脏重要的固有细胞之一,具有维持肾小球系膜区细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)代谢平衡的重要作用。在DN的发病机制中,高糖环境下可使GMCs功能障碍,进而引起ECM合成和降解失衡,使胶原蛋白、纤维连接蛋白等ECM成分在肾小球系膜区蓄积,最终导致肾小球系膜区扩张和肾小球硬化等DN主要的病理学改变。增殖细胞核抗原(Proliferation Cell Nuclear Antigen, PCNA)是一种存在于细胞核中能调节细胞增殖的蛋白,高糖环境下,PCNA蛋白表达增高,导致GMCs在系膜区不断增殖,最终导致系膜区扩张及硬化,其可作为GMCs增殖的指标。自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程,对维持细胞内环境稳定具有重要作用。DN时,氧化应激、内质网应激、转化生长因子.β1、肾素-血管紧张素系统激活、缺氧等肾脏损伤因素在损伤肾脏的同时诱导细胞自噬,进而维持细胞稳态与存活,而高糖条件下可导致GMCs自噬功能受到抑制,从而加重了损伤因素对肾脏系膜细胞的损伤。然而,在糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)状态下的肾脏组织中,诱导细胞自噬的损伤因素增多,具有细胞保护作用的自噬现象不但没有代偿性增高,反而处于抑制状态,这种损伤作用增强、保护作用减弱的矛盾提示,DM状态下GMCs的自噬功能缺陷可能参与了DN的发生与发展,为我们探究DN的发病机制提供了新思路。MicroRNAs是一种内源性非编码单链核苷酸,其长度约为19-25个核苷酸。microRNAs调节了细胞生长,组织分化,参与多种细胞学行为,因而与生命过程中发育、疾病密切相关。现已证实microRNA的种子序列能通过完全或几乎完全碱基互补配对的方式与靶基因mRNA 3'端非编码区相结合从而引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译,进而在转录后水平调节基因的表达。miR-101是众多microRNAs中的一员,近年来多有文献报道miR-101能够通过抑制肿瘤细胞的自噬反应,增加肿瘤细胞对放化疗药物的敏感性,也有报道其表达量下降能在体内或体外抑制肿瘤的生长。Chigusa Higuchi等发现,2型糖尿病患者(Type 2 diabetes, T2D)血清中log10miR-101的浓度比正常糖耐量患者(Normal glucose tolerance, NGT)明显增高。miR-101在动物体内多种组织中的表达谱显示,它在胰腺组织中高表达,而T2D组血清中高表达的miR-101除了来源于胰腺组织还是可能来源于其他组织?目前还不清楚。在肿瘤细胞中,miR-101能通过负性调控靶基因(如E2H2、STMN1、RAB5A、ATG4D等)的表达抑制肿瘤细胞的自噬反应,增强其凋亡。在DN中,高糖可以抑制GMCs的自噬反应,而miR-101在T2D患者血清中的表达量升高,且它能够靶向调控自噬基因,那么miR-101在DN的GMCs中是否表达增高,能否抑制GMCs的自噬反应,从而影响DN的发生发展。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是真核生物中高度保守的能量感受器,广泛表达于所有类型的肾脏细胞,其磷酸化活性降低与DN的发生发展关系密切,当AMP/ATP比率升高时被激活,被认为是糖尿病治疗的有效新靶点之一。有报道证明：白藜芦醇可以通过对AMPK的激活减轻DN早期的肾脏损害。AMPK对自噬作用的调节也起到关键作用,在DN中,AMPK的活性受到抑制,GMCs的自噬功能减弱,而激活AMPK信号通路可以改善高糖诱导的GMCs自噬功能障碍。因此,高糖刺激下GMCs的AMPK磷酸化活性降低与自噬抑制有关,而激活AMPK可改善高糖刺激下系膜细胞的自噬功能。综合分析TargetScan等数据库可知,miR-101的靶基因包括AMPK (Prkaal)。因此,综上所述我们假设在DN中,肾小球系膜细胞能够高表达miR-101,其中存在miR-101与AMPK的直接调控关系,miR-101能够抑制GMCs的自噬反应,促进GMCs的增殖。本课题以小鼠肾小球系膜细胞株SV40 Mes作为研究对象,首先通过体外培养SV40 Mes细胞观察高糖对SV40 Mes细胞自噬、增殖能力及miR-101表达水平的影响,然后行双荧光素酶检测验证AMPK是否为miR-101的直接靶基因,利用qRT-PCR、Western blot法分别检测转染miR-101对SV40 Mes细胞AMPK mRNA及蛋白水平的影响。最后研究高糖条件下miR-101对SV40 Mes细胞自噬、增殖能力的影响,旨在为DN的治疗提供理论依据并寻找新思路。本课题由以下两个部分的研究组成：第一部分高糖条件下小鼠肾小球系膜细胞自噬、增殖及miR-101表达量的关系,验证小鼠系膜细胞存在miR-101对AMPK的直接调控关系[目的]1.观察高糖对小鼠系膜细胞株SV40 Mes自噬、增殖能力及miR-101表达量的影响以及三者之间的关系；2.验证SV40 Mes细胞中存在miR-101对AMPK的直接调控关系。[方法]1.细胞培养：采用含10%胎牛血清的1640低糖培养基,于37℃、5% CO2培养箱内传代培养小鼠肾小球系膜细胞株SV40 Mes。2.用高糖(30mM)分别干预SV40 Mes 0、24、48、72h,同时设对照组甘露醇组(30mM)。分组：正常糖组NG、甘露醇组Man、高糖组HG以及高糖干预时间梯度组：HG 0h、HG 24h、HG 48h、HG 72h共7组。检测指标：a、用WB测各组细胞胞质型微管相关蛋白1轻链3 (Cytosolic truncated form of LC3, LC3B I).自噬体膜型微管相关蛋白1轻链3 (Autophagosomal membrane associated form of LC3, LC3B II)、AMPK、p-AMPK、PCNA的表达水平；b、用CCK8试剂盒检测各组细胞的增殖率；c、用qRT-PCR测各组细胞miR-101的表达水平。3.用mimic和inhibitor分别转染SV40 Mes,分组：NC(空白组)、miR-101-mimic、mimic-control、miR-101-inhibitor、inhibitor-control共5组。检测指标：用qRT-PCR测各组miR-101的表达水平,确认转染是否成功。4.先利用TargetScan生物信息学软件预测靶基因,再用双荧光素酶基因报告质粒验证AMPK是否为miR-101的靶基因。5.miR-101调控靶基因AMPK的mRNA和蛋白质表达水平。分组：NC、miR-101-mimic、mimic-control、miR-101-inhibitor、inhibitor-control共5组,其中高糖HG 30mM,高糖干预时间72h。检测指标：a、用qPCR测各组AMPK的mRNA表达水平；b、用WB测各组AMPK的蛋白表达水平。6.统计学处理：实验数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析,各组计量资料采用均数±标准差(x±s)表示。多组均数比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),组间多重比较采用LSD法,若方差不齐时,采用Welch法近似方差分析进行校正,组间多重比较采用Dunnett's T3法。两组均数比较采用t检验。P0.05认为差异具有统计学意义。[结果]1.高糖环境下SV40 Mes细胞自噬体形成标志蛋白LC3B的自噬水平随着刺激时间延长逐渐降低；HG 72h SV40 Mes细胞LC3B蛋白的自噬水平最低。干预72h后,HG组SV40 Mes细胞LC3B蛋白的自噬水平较NG组显著降低(P0.05)；NG组与Man组SV40 Mes细胞LC3B蛋白的自噬水平未见明显异常(P0.05)。2.高糖刺激72小时(HG 72h)后,SV40 Mes细胞内PCNA蛋白的含量较HG Oh显著增多(P0.05)；高糖刺激其他时间点SV40 Mes细胞内PCNA蛋白的含量无明显差异。干预72h后,HG组SV40 Mes细胞内PCNA的含量较正常组显著增高(P0.05)NG组与Man组SV40 Mes细胞内PCNA的含量未见统计学差异(P0.05)。3.用CCK8试剂盒检测SV40 Mes细胞增殖率：与NG组和Man组相比,HG组细胞增殖明显增强(P0.05)。HG 72h SV40 Mes细胞的增殖水平升高明显,与HG Oh相比差异有统计学意义(P0.05)。4.高糖环境下SV40 Mes细胞内p-AMPK/AMPK的表达量随着刺激时间延长逐渐降低(P0.01)；干预72h后,HG组SV40 Mes细胞内AMPK的磷酸化活性较NG组显著降低(P0.05)；NG组与Man组SV40 Mes细胞AMPK的磷酸化活性未见统计学差异(P0.05)。5.高糖环境下SV40 Mes细胞内miR-101的表达量随着刺激时间延长逐渐升两(P0.01); HG 72h SV40 Mes细胞miR-101的表达量最高。干预72h后,HG组SV40 Mes细胞内miR-101的表达量较NG组显著升高(P0.05)；NG组与Man组SV40 Mes细胞miR-101的表达均未见统计学差异(P0.05)。6.用qRT-PCR法检测转染miR-101后转染组与正常组、转染对照组的miR-101表达水平,检验SV40 Mes细胞miR-101的转染效率。结果显示：miR-101-mimic转染组miR-101的表达含量比mimic-control组明显增高,其相对含量是mimi-control组的37倍(P0.05)；而miR-101-inhibitor组miR-101的表达量比inhibitor-control组明显降低80%(P0.05),差异有统计学意义。7.利用TargetScan等生物信息学软件对miR-101的靶基因进行预测,重点选择了AMPK (Prkaal);按照实验分组转染SV40 Mes细胞后测定双荧光酶素活性,数据显示共转染AMPK-3'UTR和miR-101-mimic的细胞样本中荧光素酶活性强度相比对照组显著下调,而Mut-AMPK-3'UTR和miR-101-mimic共转染的细胞样本中荧光素酶活性下降不明显,这说明AMPK是miR-101的直接靶基因。8.将miR-101-mimic和miR-101-inhibitor分别转染SV40 Mes细胞,检测AMPK的蛋白和转录水平的改变。与空白组(NC组)及阴性对照组相比,miR-101-mimic转染SV40 Mes细胞后AMPK mRNA的转录水平及细胞内AMPK蛋白含量显著降低(P0.05),而miR-101-inhibitor组AMPK mRNA的转录水平及细胞内AMPK蛋白含量明显升高,均具有统计学意义(P0.05)。[结论]1.高糖抑制SV40 Mes细胞自噬相关蛋白的表达,其作用与渗透压无关；可见,在DM状态的肾脏中,葡萄糖毒性损伤了GMCs的自噬功能。2.高糖诱导SV40 Mes细胞内PCNA蛋白表达量增加,其作用与渗透压无关；高糖促进SV40 Mes细胞的增殖。3.高糖使SV40 Mes细胞内miR-101的表达量增加,其作用与渗透压无关。4.在高糖诱导SV40 Mes细胞内miR-101表达量增加中,自噬减弱、增殖能力增强与miR-101增加有关。5.高糖诱导SV40 Mes细胞内AMPK的蛋白表达水平与miR-101的表达量呈负相关。6.miR-101的种子序列能与AMPK-3'UTR直接结合并降低AMPK mRNA及蛋白的表达水平。7.miR-101可能通过调控AMPK的表达抑制SV40 Mes细胞自噬、促进其增殖。第二部分验证miR-101调控SV40 Mes细胞的自噬、增殖能力[目的]证明miR-101能调控高糖条件下SV40 Mes细胞的自噬、增殖能力。[方法]1.细胞培养：同第一部分。2.miR-101抑制高糖环境下SV40 Mes细胞的自噬反应。分组：NG、HG、miR-101-mimic+HG、mimic-control+HG、miR-101-inhibitor+HG、 inhibitor-control+HG共6组。检测指标：a、用透射电子显微镜观察各组细胞的自噬体形态并计数；b、用WB测各组细胞LC3B Ⅰ、LC3B Ⅱ蛋白的表达水平。3.miR-101促进高糖环境下SV40 Mes细胞的增殖能力。分组：NG、HG、 miR-101-mimic+HG、mimic-control+HG、miR-101-inhibitor+HG、 inhibitor-control+HG共6组。检测指标：a、用WB测各组细胞PCNA的蛋白表达水平；b、用CCK8试剂盒检测各组细胞的增殖率。4.统计学处理：同第一部分。[结果]1.加入高糖后显示：miR-101-mimic组SV40 Mes细胞的自噬体形成标志蛋白LC3B自噬水平较高糖组明显下降,差异有统计学意义(P0.05)；而miR-101-inhibitor组LC3B蛋白自噬水平比高糖组高,差异有统计学意义(P0.05)。2.在透射电子显微镜下,加入高糖后miR-101-mimic转染组SV40 Mes细胞内自噬体(以包含未消化细胞质内容物的特殊双膜结构为特征)个数明显减少,具有统计学意义(P0.05); miR-101-inhibitor转染组细胞内自噬体个数最多。3. SV40 Mes细胞在高糖条件下,miR-101-mimic组的PCNA蛋白含量较高糖组显著升高,差异有统计学意义(P0.05)；而miR-101-inhibitor组PCNA蛋白含量比高糖组低,差异有统计学意义(P0.05)。4.用CCK8法检测高糖条件下SV40 Mes细胞增殖水平,加入高糖后,miR-101-mimic转染组细胞增殖水平比高糖组明显增高,差异有统计学意义(P0.05)；而miR-101-inhibitor转染组细胞的增殖水平最低。[结论]miR-101能抑制高糖条件下SV40 Mes细胞的自噬反应,促进其增殖能力。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692.9;R587.2
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，本文编号：1327636
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