结节性硬化症的基因型与表型关系及IGF-1水平变化研究

发布时间：2017-12-24 21:21

本文关键词：结节性硬化症的基因型与表型关系及IGF-1水平变化研究　出处：《南方医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：结节性硬化症(tuberous sclerosis complex,TSC)是一种由于细胞增生和组织发育异常导致多器官损害的神经皮肤综合征,为常染色体显性遗传病。TSC在任何器官可引起局限的、良性的、非侵袭性损害。组织损害的数量、大小、分布及随意性导致了各种各样的临床表现,影响包括大脑、皮肤、肾脏、心脏、眼睛及肺部。癫痫是TSC最常见的神经病学症状,出现在85%的患者。TSC患者与广泛的认知、行为和精神问题有关。约5-15%的TSC患者合并室管膜下巨细胞星形细胞瘤。面部血管纤维瘤出现在75%的TSC患者中,它们通常在2到5岁开始出现,是TSC患者最常见的皮肤表现。其他皮肤损害包括引起皮肤色素脱失斑、甲周或牙龈纤维瘤、皮下组织增厚变硬,后者损害通常位于低位的后背、臀部或躯干(即鲨鱼皮样斑)以及前额、面部(即额前纤维斑)。。肾脏表现为TSC患者第三大最常见的临床特征,包括4种类型损害：血管平滑肌脂肪瘤(AMLs)、孤立肾囊肿、常染色体显性遗传多囊肾病(PKD)和肾细胞癌。心脏横纹肌瘤与TSC特异相关,很少在TSC以外的个人中出现。心脏横纺肌瘤是心脏的良性肿瘤,一般不会引起严重的医学问题,常常是TSC第一个被察觉的临床表现。视网膜错构瘤见于30-50%的TSC患者,其组织学特征与TSC患者的大脑结节相类似。TSC患者的肺部损害有3种类型：肺淋巴管肌瘤病(LAM),多中心微结节样肺泡细胞增生症(multifocal micronodular pneumocytes hyperplasia),肺囊肿。TSC可由不同的2个基因突变而引起：TSC1基因(位于染色体9q34)和TSC2基因(位于染色体16p13)。TSC1基因编码hamartin(错构瘤蛋白),TSC2基因编码tuberin(马铃薯球蛋白)。Hamartin的分子量为130kDa, tuberin是分子量为198kDa,都是肿瘤抑制物,在进化上高度保守。人类TSC1基因有23个外显子,其中3号至23号外显子具有编码功能,2号外显子具有多种剪接方式。Hamartin在氨基酸127-144为一个潜在的跨膜区,在氨基酸730-996为一个卷曲螺旋结构。余下的氨基酸145-510对激活Ras相似物GTP酶(RhoGTPase)既是必要也是充分的,而氨基酸881-1084可与ERM (ezrin-radixin-moezin)家族中的肌动蛋白结合蛋白的N末端相互作用。TSC2基因与端粒大约相距2.25Mb,紧邻多囊肾病(PKD1)基因。TSC2基因的结构复杂,包含41个外显子,而内含子较小。5.5kb的TSC2基因转录编码含1784个氨基酸的tuberin,其中81-98位氨基酸(外显子3)有一亮氨酸拉链,氨基酸346-371(外显子10)和氨基酸1008-1021(外显子26)为2个小的卷曲螺旋结构,氨基酸1593-1631(外显子34-38)是一个与GTP酶激活蛋白GAP3或Rap1 GAP相似的结构域。截至本文完稿之时,已有840种TSC1和2354种TSC2独特的等位基因变异体被报道(www.lovd.nl/TSC 1, www.lovd.nl/TSC2)。这些突变包括无义、错义、插入和缺失等常见突变之组合,几乎涉及TSC1和TSC2的所有外显子。结节性硬化症的病理特征为多器官的细胞增生和组织发育异常。TSC的发病与mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)信号通路密切相关。目前认为mTOR信号通路的上游刺激因子包括氨基酸、葡萄糖、WNT配体、氧气、cAMP(环腺苷酸)和胰岛素/IGF-1。在TSC1、TSC2基因及其编码蛋白(hamartin和tuberin)被发现后,随后的遗传和功能研究确认了其下游的作用靶点及相关信号放大系统。TSC1编码的hamartin蛋白与TSC2编码的tuberin蛋白,结合第三个蛋白TBC1D7,组成TSC蛋白复合物,该复合物能调控多种细胞的生长进程,而更为重要的,它是下调mTORC1(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1)活性的关键因子。mTORC1是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,对细胞生长及分化等多种细胞功能具有中央调控作用。Rheb是TSC蛋白复合物下游的一种特异性鸟苷三磷酸酶(GTP酶),它介导TSC1/TSC2向mTORC1的功能连接。TSC1/TSC2复合物具有GTP蛋白激酶功能,作用于Rheb,促使Rheb-GTP转换为GDP结合状态,因而使Rheb失活,进而抑制其对mTORC1的激活。反之,如TSC1或TSC2的基因突变致其功能丧失,则会导致Rheb-GTP的信号增强并激活mTORC1。因此,mTORC1信号系统的持续激活就构成了结节性硬化症的分子学发病基础。国内对结节性硬化症研究仍比较薄弱,多为少数个案的报道,对于基因突变型与临床表型关系目前很少报道,对TSC发病机制的研究更少。基于目前国内外的研究状况,我们进行了两方面的研究：一、对部分临床确诊的结节性硬化症患者进行TSC1和TSC2基因检测,以明确其基因突变结果,同时我们搜集了国内有明确致病基因突变的160例结节性硬化症病人资料,汇总后进行统计分析,总结基因突变的特点,探讨基因突变类型与临床表型的关系。本课题从基因水平对结节性硬化症进行深入研究,将丰富我国结节性硬化症基因突变的数据库,明悉基因型与表型关系,为判断患者预后及提供个体化治疗提供理论依据。二、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是mTOR信号通路的上游刺激因子之一,近年研究发现IGF-1在肿瘤的发生发展中起重要作用。本文研究TSC患者的血清IGF-1水平变化,以探索IGF-1能否用于评价TSC病情和作为治疗靶点,了解TSC患者体内多脏器错构瘤与IGF-1有无关系。第一部分摘要：结节性硬化症的基因突变与临床表型关系[目的]检测8名结节性硬化症患者的基因突变方式,总结节国内结节性硬化症基因突变特点,探讨基因突变类型与临床表型的关系。[方法]1.收集血样本：参照1998年国际结节性硬化症协会委员会制定的结节性硬化症的诊断标准,我们收集了5个结节性硬化症家系,家系患者8名,家系成员16名,家系之间无血缘关系,在征得病人家属知情同意后,进行基因检测。基因检测方法：通过目标序列捕获结合高通量测序技术对患者的TSC1和TSC2基因进行检测,部分检测程序由基因检测公司完成。2.收集文献：采用文献顺查检索法,从国内中文医学数据库(中国期刊网、万方数据、维普医学网、中国知网)检索1995至2014年有关结节性硬化症基因突变的文献共30篇,搜集有基因诊断的结节性硬化病例160例,剔除重复报导的、基因突变为单核苷酸多态性的病例,结合本院基因突变阳性者6名。统计学方法：运用SPSS16.0软件进行分析。用卡方检验或Fisher's确切概率法对以下组别的临床表现进行比较分析：(1)男性组和女性组；(2)有家族史组和散发病例组；(3)TSC1组和TSC2组；(4)错义突变组和其他类型突变组。P0.05为差异有统计学意义。[结果]一、5个结节性硬化家系患者的TSC基因突变阳性6例,阴性2例,以TSC1突变为主(4例TSC1突变,2例TSC2突变)1.家系1先证者检测到TSC2基因突变：TSC2 c.826_827delAT, p.Met276Valfs*61。 cDNA的826和827碱基缺失(A和T),导致第276位密码子由原来编码蛋氨酸变为缬氨酸,并引起氨基酸序列在第337位提前出现终止密码。其父母该位点均未检测出突变。2.家系2先证者检测到TSC1基因杂合突变：TSC1 c.1888_1891delAAAG, p.Lys630GlnfsX22杂合。编码区第1888至1891号核苷酸AAAG缺失,导致第630号密码子由原来编码Lys(赖氨酸)变为Gln(谷氨酰胺),并于此后第22位密码子提早出现终止密码。其父母该位点均未见异常。3.家系3先证者检测TSC1基因杂合突变：TSC1 c.836_837insT(p.Leu279fs)。患者TSC1基因发现c.836_837insT(编码区第836_837号核苷酸间插入核苷酸T)的杂合核苷酸变异,该变异导致第279号氨基酸Leu(亮氨酸)开始的氨基酸合成发生改变(p.Leu279fs),为移码变异。受检者其父该位点为杂合子,其母该位点未见异常。4.家系4先证者检测TSC2基因杂合突变：TSC2 c.2713C＞T p.Arg905Trpo编码区第2713号核甘酸由C变成T,该变异导致第905号氨基酸Arg(精氨酸)变为Trp(色氨酸),为错义突变。5.家系5中有结节性硬化症患者4名,其中2名患者(Ⅲ3和Ⅲ5)检测到突变：TSC1 exon7 del (TSC1基因缺失了第7号外显子)。另外2名患者Ⅱ 3、Ⅱ5以及2名健康成员Ⅱ4、Ⅲ4的TSC基因检测未见明显异常。6例结节性硬化症的临床特点：共同点为全部有癫痫发作,脑部MRI可见室管膜下结节或钙化灶,皮肤见有色素脱失斑或鲨鱼皮样斑,6例患者中4例存在智力减退,2例合并心脏心脏横纹肌瘤,1例合并室管膜下巨细胞瘤。二、国内已明确结节性硬化症TSC基因突变的160名患者以TSC2突变为主,81.9%为TSC2突变(131/160),18.1%为TSC1突变(29/160)1.基因突变位点分布：TSC1基因突变28例,以第15、21、18号外显子为主。TSC1基因共有23个外显子,其中第15号外显子较长,其突变所占比例最大34.5%(10例)。TSC2基因突变主要发生于第37、40、和33号外显子,所占比例分别为9.9%(13例)、7.6%(10例)和6.9%(9例)；2.基因突变类型：TSC1常见突变以缺失突变(31.0%)和错义突变(31.0%)为主,在TSC2上以错义突变(32.1%)、缺失突变(21.4%)及无义突变(20.6%)为常见。3.160例结节性硬化症的临床特点收集的160例结节性硬化症患者最常见的临床表现为：色素减退斑(发生率79.8%)、面部血管纤维瘤(75.6%)、室管膜下结节或钙化灶(73.6%)、癫痫(71.6%)三、综合166例(本文6例,文献检索160例)结节性硬化症患者的基因及临床资料,分析基因型与临床表型关系：1.TSC1与TSC2突变临床表现的对比：TSC1突变组病例33例,TSC2突变133例,TSC1组患者色素减退斑发生率为60.0%(15/25)、TSC2组84.0%(84/100),TSC2组发生率高于TSC1组且组间差异具有统计学意义(χ2=6.993,P=0.008)；TSC1组患者大脑皮质结节发生率为30.8%(4/13)TSC2组64.6%(31/48),TSC2组发生率高于TSC1组(χ2=4.783,P=0.029)。采用Wilcoxon符号秩检验比较TSC1组和TSC2总体临床表现的发生率,得出统计量Z=-2.691,P=0.007,小于0.05,故可认为TSC2组的总体临床表现的发生率更高,TSC2突变组病情比TSC1突变组更严重。2.错义突变和其他类型突变临床表现的对比：本研究中错义突变病例52例；其他类型突变114例分别为无义突变(31例)、插入突变(22例)、缺失突变(39例)、剪接突变(15例)和基因大片段缺失(7例)。其中1例缺失突变导致所编码功能蛋白缺失6个氨基酸,其余缺失突变和插入突变均引起移码突变；无义突变引起编码蛋白部分截断,剪接突变和基因大片段缺失引起大片段基因插入或缺失,错义突变仅引个一个氨基酸改变。将错义突变和其他类型突变进行对比,以研究基因突变导致编码蛋白单个氨基酸改变和多氨基酸改变后其临床表型是否存在差异,统计结果显示错义突变组和其他突变组患者的临床表现无明显差异,提示TSC基因所编码蛋白的单个氨基酸改变与多氨基酸改变对临床症状的影响无明显差异。[结论]1.我国结节性硬化症患者TSC基因突变大部分为TSC2基因为主。TSC2基因的外显子37、40、33较容易发生突变。TSC1基因的外显子15、21较容易发生突变。2.结节性硬化症临床表型共同点为癫痫发作、颅内高密度灶等。TSC2基因突变患者的色素减退斑、大脑皮质结节的发生率比TSC1突变者高。TSC2突变病情比TSC1突变更严重。第二部分摘要：结节性硬化症的胰岛素样生长因子-1水平变化[目的]研究结节性硬化症(TSC)患者血清胰岛素样生长因子-1(IGF—1)水平的变化及临床意义。[方法]30例TSC患者为实验组,30名性别及年龄与实验组相匹配的健康人为对照组,使用化学发光法检测两组的血清IGF—1水平。采用两配对样本的Wilcoxon符号秩和检验法,检验结节性硬化症患者血清IGF—1水平与健康人是否有差异。P0.05为差异有统计学意义。[结果]实验组的血清IGF—1水平为78.95(43.53,135.75)ng/mL,对照组血清IGF-1水平为83.05(55.08,173.50)ng/mL,比较两组无显著差异。[结论]TSC患者的血清IGF—1水平与正常人比较无明显变化,血清IGF—1能否作为TSC病情评估指标有待进一步研究。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R596.1

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