高脂条件下ALA对胰岛素抵抗大鼠及HepG2细胞脂类代谢的影响

发布时间：2018-01-24 13:26

  本文关键词： n-3多不饱和脂肪酸 脂类合成 胰岛素抵抗 胰岛素诱导基因　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：1目的胰岛素抵抗(IR)不仅可以诱发Ⅱ型糖尿病,而且可以诱发诸多代谢性疾病,严重危害人类健康。目前,对胰岛素抵抗进行干预进而防治糖尿病的发展和恶化已经成为一个研究热点,非药物性干预是其中的一个重要手段。严重的脂代谢紊乱及胰岛素作用靶器官、组织对胰岛素敏感性的降低组成了IR的重要病理特征,而脂代谢紊乱又是动脉粥样硬化、高血压、冠心病等诸多代谢性疾病的重要危险因素之一。所以,改善脂代谢紊乱已经成为干预、治疗IR的一个重要措施。获得与人类发病机理相似的IR动物模型是开展相关研究的关键,高脂饮食作为重要的环境条件可成功诱发肥胖型IR动物模型。n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)作为长链多不饱和脂肪酸,其命名来源于第一个不饱和双键距离甲基端的碳原子数目。目前,越来越多的研究关注n-3PUFA饮食的高脂血症防控功能,以期获得科学数据,进而用以预防和治疗脂代谢紊乱相关疾病。研究表明,n-3PUFA可以预防高脂饮食诱发大鼠胰岛素抵抗,但n-3PUFA对胰岛素抵抗大鼠的改善及脂代谢调节作用的机理尚不明确。n-3PUFA包括α-亚麻酸(ALA,C18:3)、二十碳五烯酸(EPA,C20:5)和二十二碳六烯酸(DHA,C22:6),相对于DHA和EPA而言,ALA的相关研究较少。本研究利用血生化分析、比色法、气相色谱、超速离心等分析技术,冷冻切片、常规病理染色等病理形态学分析实验技术,real-time q PCR以及Western blot等分子生物学技术,分析在n-3PUFA干预后,IR动物与细胞模型脂类合成关键基因表达水平的变化,为ALA在IR脂代谢紊乱的改善及治疗中的进一步应用提供科学数据。2内容本实验通过给予胰岛素抵抗大鼠富含苏子油的高脂日粮,分析在保持日粮总能量不变的情况下,苏子油高脂饮食干预对IR大鼠血脂生化指标,肝脏及血清ALA含量,肝脏胆固醇(TCH)、甘油三酯(TG)合成关键基因m RNA、蛋白表达水平及肝脏脂肪沉积的影响,并首次探究其是否通过调控胰岛素诱导基因-1(INSIG-1)/胰岛素诱导基因-2(INSIG-2)的mRNA、蛋白表达来影响脂类的合成;在动物实验基础上进一步从细胞水平分析,同样替代比例的ALA对软脂酸处理后的胰岛素抵抗Hep G2(IR-Hep G2)细胞模型上述基因m RNA、蛋白表达的影响,综合分析体内与体外实验结果,探讨ALA对IR脂代谢紊乱的影响及可能机制。3方法将48只SPF级雄性SD大鼠随机分为2组进行胰岛素抵抗造模:对照组(NC)12只、高脂组(HF)36只。当HF组大鼠出现胰岛素抵抗后,将出现胰岛素抵抗的24只HF组大鼠随机分为2组:HF、苏子油组(PO),每组12只。干预4周后,气相色谱法检测大鼠血清及肝脏ALA含量,酶法检测血清及肝脏TCH、TG水平,real time q PCR检测TG、TCH合成关键基因m RNA水平,Western blot检测TG、TCH合成关键基因蛋白表达量。Hep G2细胞造模期同样分为两组,由无血清培养基培养的对照组(NC)以及用来诱发IR-Hep G2细胞模型的含有0.25mmol/L软脂酸的无血清培养基培养的软质酸组(PA),培养24h后测定细胞内TCH、TG水平,并用无酚红低糖培养基鉴定胰岛素抵抗细胞模型,模型成立后用20%ALA替代软脂酸培养12h,再次检测细胞内TCH、TG水平,real time q PCR检测TG、TCH合成关键基因m RNA水平,Western blot检测TG、TCH合成关键基因蛋白表达量。4结果4.1大鼠(1)分析造模期采食量可以得知,HF组大鼠能量摄入及脂肪形式能量摄入均显著高于NC组(P0.0001);血清生化指标结果显示,HF组大鼠血清TG水平显著高于NC组(P0.05),而两组大鼠血清TCH水平并没有统计学差异;高胰岛素-正常血糖钳夹实验结果显示,HF组大鼠葡萄糖灌注率(GIR)显著低于NC组(P=0.0086),HF组大鼠产生胰岛素抵抗,说明造模成功;(2)苏子油高脂饮食干预4周后,随着PO组大鼠ALA摄入量显著高于HF组(P0.0001),PO组大鼠血清、肝脏内ALA含量均显著升高(P=0.0006),伴随着大鼠血清及肝脏TG含量的显著降低(P0.05),肝脏病理切片结果显示脂肪沉积得到明显改善,而两组大鼠血清与肝脏TCH水平及胰岛素敏感性并没有体现出统计学差异;(3)实时定量PCR结果显示,与HF组相比,PO组INSIG-2基因m RNA相对表达量显著升高(P=0.005),SREBP-2基因m RNA相对表达量显著降低(P=0.042);而INSIG-1、SREBP-1、FASN、HMGCR基因m RNA相对表达量与HF组相比无统计学差异;(4)蛋白表达结果显示,与HF组相比,PO干预后IR大鼠肝脏INSIG-2表达量显著升高,FASN、HMGCR表达量显著降低,而两组INSIG-1表达量无统计学差异;与HF组相比,PO组125k Da SREBP-1c表达无明显变化,65k Da SREBP-1c表达及65k Da/125k Da SREBP-1c比值均显著降低,而126k Da SREBP-2表达、55k Da SREBP-2表达、55k Da/126k Da SREBP-2比值均显著降低。4.2 Hep G2细胞(1)0.25mmol/LPA培养细胞24h后,虽然细胞活性有所下降,而PA组Hep G2细胞葡萄糖摄取量显著低于NC组(P=0.0007),说明IR-Hep G2细胞模型建立成功,进一步检测细胞内脂类水平发现,PA组TG、TCH水平均有不同程度的升高,但只有TCH水平显著高于NC组(P=0.0016),出现了脂代谢紊乱;(2)ALA干预IR-Hep G2细胞12h后,细胞活性有所恢复,与PA组相比,ALA组INSIG-1/2基因及脂类合成关键蛋白的基因m RNA表达无明显影响,但是对SREBP-2基因m RNA表达的抑制率为32%;(3)与大鼠体内结果相同的是,ALA干预后可以特异性的提升细胞内INSIG-2蛋白相对表达量,且对INSIG-1蛋白相对表达量没有明显变化。ALA组与TG合成相关的65k Da SREBP-1c蛋白表达有所降低,但没有差异,而ALA组FASN蛋白表达量降低了21%。同时,ALA可以显著抑制55k Da SREBP-2、HMGCR蛋白的表达,抑制率分别为43%、79%,TCH合成明显受抑制。与体内实验相同的是,与PA组相比,ALA组只有细胞内TG水平显著降低(P=0.0119),而细胞内TCH水平无统计学差异。5结论5.1大鼠(1)在持续高脂饮食的情况下,给予IR大鼠补充0.556g/d ALA,可通过提升INSIG-2蛋白表达,抑制SREBP-1c从内质网到高尔基体的移位剪切活化,进而降低65k Da SREBP-1c水平及下游靶基因FASN的表达、肝细胞内TG的合成,从而降低细胞内TG水平及改善IR大鼠脂质代谢紊乱;(2)苏子油高脂饮食虽然通过提升INSIG-2表达抑制了TCH合成关键酶SREBP-2及其下游靶基因HMGCR的表达,但是并没有降低血清及肝脏TCH含量;(3)苏子油高脂饮食可以特异性促进IR大鼠肝脏INSIG-2基因m RNA、蛋白表达,对INSIG-1基因m RNA、蛋白表达无明显影响。5.2 Hep G2细胞(1)0.25mmol/LPA培养细胞24h可以诱发Hep G2细胞胰岛素抵抗,并且伴有细胞脂代谢异常和细胞活性的降低;(2)0.05mmol/LALA可以改善IR-Hep G2细胞中脂代谢紊乱,但对其胰岛素敏感性无显著影响,且与体内结果一样,ALA只显著降低细胞内TG水平,而对细胞内TCH没有明显影响;(3)与体内结果一致的是,ALA特异性促进IR大鼠肝脏INSIG-2蛋白表达,对INSIG-1基因m RNA、蛋白表达无明显影响;(4)ALA干预IR-Hep G2细胞后,通过INSIG-2蛋白表达的显著升高,进而抑制SREBP-2从内质网到高尔基体的剪切成熟活化,降低细胞内55k Da SREBP-2水平及下游靶基因HMGCR的表达,并且抑制FASN表达,从而抑制了TG/TCH的合成。
[Abstract]:1 insulin resistance (IR) can not only induce type II diabetes, and can induce many metabolic diseases, serious harm to human health. At present, the development and progression of intervention on insulin resistance and diabetes has become a hot topic of research, non drug intervention is one of the important means. Serious lipid metabolism disorder and insulin target organs, reduce the tissue sensitivity to insulin have important pathological characteristics in IR, and lipid metabolism disorder and atherosclerosis, hypertension, one of the important risk factors of coronary heart disease and other metabolic diseases. Therefore, improving lipid metabolism has become an important measure of intervention for the treatment of IR. IR animal the model is similar to the pathogenesis of human is the key to carry out related research, high fat diet as an important environmental conditions can be successfully induced obese IR animal model Type.N-3 polyunsaturated fatty acid (n-3PUFA) as long-chain polyunsaturated fatty acids, the number one unsaturated double bond distance methyl end carbon atoms of the origin of its name. At present, hyperlipidemia prevention function more and more research on the n-3PUFA diet, in order to obtain scientific data, and then to prevent and treatment of lipid metabolism related diseases. The results show that n-3PUFA can prevent insulin resistance in rats induced by high fat diet, but the mechanism of n-3PUFA on the improvement of insulin resistance and lipid metabolism in rats of the regulation is not clear.N-3PUFA including alpha linolenic acid (ALA, C18:3), twenty carbon (EPA, C20:5) five AA and twenty-two six carbon acid (DHA, C22:6), compared with DHA and EPA, ALA related research less. This study by blood biochemical analysis, colorimetric method, gas chromatography and ultracentrifugation analysis techniques, frozen sections, routine pathological staining pathological morphology Analysis of experimental technology, real-time Q PCR and Western blot and other molecular biology techniques, analysis of the intervention in n-3PUFA, changes in the level of IR and animal cell model of lipid synthesis key gene expression, to provide scientific data for.2 content given high fat diet rats with insulin resistance in Perilla seed oil by this experiment for the further application of ALA in improving and treatment IR lipid metabolic disorder in the analysis of total energy diets keep unchanged, perilla oil and high fat diet intervention on blood lipid of IR rats and the liver biochemical indexes, the content of ALA in serum, liver cholesterol (TCH), triglyceride (TG) synthesis of key genes M RNA, protein expression level and hepatic fat deposition for the first time, and to explore whether through the regulation of insulin induced gene -1 (INSIG-1) / insulin induced gene -2 (INSIG-2) mRNA and protein expression to affect lipid synthesis; based on animal experiments. 涓，

本文编号：1460149