染氟大鼠肝脏、成骨组织及大鼠原代成骨细胞中LC3A、Becin-1、Bcl-2、Bax的表达及对成骨细胞损伤机制研究
发布时间：2018-01-28 09:22
本文关键词： 微管相关蛋白轻链3 哺乳动物ATG6同源蛋白) B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白 B细胞淋巴瘤/白细胞基因伴随蛋白x 3-甲基腺嘌呤 氟中毒 肝脏 成骨细胞 出处：《贵州医科大学》2017年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：目的:研究慢性氟中毒大鼠肝脏组织、成骨组织及染氟大鼠原代成骨细胞中自噬相关因子LC3A、Beclin-1及凋亡因子Bcl-2、Bax的蛋白及其m RNA的表达水平;探讨自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methy ladenine,3-MA))与自噬、凋亡的相互关系,以及氟中毒损伤成骨细胞机制。方法:1.将36只健康SD大鼠按体重随机分为对照组、低氟组、高氟组,分别用含氟量1mg/L的自来水和含氟5、50mg/L的含氟水饲养6个月,观察氟斑牙形成情况;测定尿氟、骨氟含量以及大鼠肝功能;苏木素-伊红染色观察肝脏病理学改变;免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)和蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)法检测大鼠肝脏组织、成骨组织中微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein light chain 3A,LC3A)、哺乳动物ATG6同源蛋白(a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30,Beclin-1)及B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell leukemia/lymphoma 2,Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白细胞基因伴随蛋白x(Bcl-2 associated x protein,Bax)的蛋白表达水平。2.原代培养SD乳鼠颅骨中的成骨细胞(Osteoblast,OB),采用CCK-8法分别检测氟化钠、3-MA的适合浓度以及时间段,原代细胞传至第三代后分成6组:对照组:含氟量为0mg/L、实验组:染氟(氟化钠Na F)分别为2.5(低氟组)、5(高氟组)mg/L,对照+3-MA组、低氟+3-MA组、高氟+3-MA组。WB和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测LC3A、Beclin-1、Bcl-2、Bax的蛋白及m RNA的表达水平;流式细胞仪检测细胞的凋亡情况;。结果:1.与对照组尿氟和骨氟[(1.92±0.12)mg/L、(185.57±13.27)mg/Kg]比较,低、高氟组大鼠尿氟含量分别为[(2.18±0,14)mg/L、(2.40±0.19)mg/L]、骨氟含量[分别为(237.42±18.48)mg/Kg、(248.00±14.72)mg/Kg]均明显升高(P0.05)。染氟组大鼠肝脏肝细胞索排列稍有紊乱,肝细胞水肿,病理形态学改变不明显。与对照组比较,染氟组大鼠血清中谷丙转氨酶(alanine transaminase ALS)活性及谷草转氨酶(aspartate aminotransferaseAST)活性明显升高,总蛋白(TP)与白蛋白(ALB)活性逐渐下降(P0.05)。免疫组化示:低、高氟组大鼠肝脏组织中LC3A蛋白[(35.35±2.71)、(44.10±6.72)]、Beclin-1蛋白[(57.56±12.1)、(74.76±18.67)]及Bax[(51.1±9.23)、(62.32±10.3)]的表达明显高于对照组[(27.55±2.33)、(40.34±6.89)(40.00±8.03)],Bcl-2蛋白表达分别为[(55.18±8.36)、(39.05±6.91)]明显低于对照组(79.71±10.92)(P0.05);低、高氟组大鼠成骨组织中LC3A蛋白[(38.42±3.05)、(50.72±4.73)]、Beclin-1蛋白[(60.64±9.32)、(80.19±11.78)]、Bax蛋白[(51.26±11.05)、(64.93±12.74)]的表达明显高于对照组[(25.79±2.57)、(38.52±7.23)、(36.94±9.48)],染氟组中Bcl-2蛋白表达分别为[(62.67±9.63)、(47.73±7.43)]明显低于对照组(83.54±11.43)(P0.05)。WB实验显示:低、高氟组大鼠肝脏组织中LC3A蛋白[(1.311±0.123),(1.633±0.100)]、Beclin-1蛋白[(1.278±0.158)、(1.691±0.283)]、Bax蛋白[(0.473±0.075)、(0.678±0.048)]的表达分别高于对照组[(0.961±0.110)、(0.579±0.104)、(0.288±0.021)];低、高氟组Bcl-2蛋白[(0.826±0.117)、(0.599±0.013)]的表达明显低于对照组(1.188±0.156)(P0.05)。2.培养24h的染氟组(0、2.5、5、10mg/L)细胞增殖率分别为(100%、131.38%、151.82%、115.80%),48h的增殖率分别为(100%、115.87%、83.31%、79.06%),72h的增殖率分别为(100%、80.91%、81.22%、66.66%)。染氟组处理24h后,分别用自噬特异性抑制剂3-MA(浓度2.5、5、10mmol/L)处理24h后,10mmol/L的3-MA对细胞的抑制率为52.1%。Beclin-1、LC3A、Bcl-2、Bax的蛋白及m RNA在对照组、对照+3-MA两组之间的表达差异均无统计学意义(P0.05)。WB实验显示:大鼠成骨细胞中低、高氟组大鼠成骨细胞中LC3A蛋白[(1.271±0.254)、(1.680±0.158)]、Beclin-1蛋白[(1.245±0.240)、(1.561±0.443)]、Bax蛋白[(1.252±0.060)、(1.001±0.190)]的表达明显高于对照组LC3A蛋白(0.726±0.152)、Beclin-1蛋白(0.668±0.122)、Bax蛋白(0.879±0.890);Bcl-2蛋白[(0.616±0.08)、(0.894±0.153)]表达较对照组(1.276±0.670)明显下降。3-MA处理染氟细胞后,LC3A蛋白[(0.655±0.023)、(1.006±0.100)]、Beclin-1蛋白[(0.789±0.168)、(1.187±0.201)]、Bcl-2蛋白[(0.434±0.047)、(0.581±0.056)]的表达与同浓度染氟组相比明显下降;而Bax蛋白[(1.546±0.057)、(1.289±0.088)]的表达水平与同浓度染氟组相比升高,以低氟+3-MA组升高最明显(P0.05)。Real-time PCR实验结果示:低、高氟组成骨细胞中LC3Am RNA[(2.381±0.205)、(3.154±0.384)]、Beclin-1 m RNA[(0.978±0.104)、(1.129±0.156)]、Bax m RNA[(2.348±0.254)、(1.508±0.147)]的表达水平较对照组LC3Am RNA(1.562±0.148)、Beclin-1 m RNA(0.697±0.057)、Bax m RNA(1.248±0.136)明显升高,3-MA处理染氟成骨细胞后LC3A m RNA[(1.473±0.129)、(1.936±0.204)]、Beclin-1 m RNA[(0.508±0.054)、(0.903±0.106)]、Bcl-2 m RNA[(0.202±0.032)、(0.378±0.040)]的表达水平较相同浓度染氟组降低,染氟成骨细胞经3-MA处理后Bax m RNA[(3.872±0.367)、(2.408±0.289)]的表达水平较同浓度染氟组升高,以低氟+3-MA组升高最明显(P0.05)。流式细胞术检测示:对照组(16.85%)和对照+3-MA(17.14%)凋亡率差异无统计学意义(P0.05),低氟组(25.04%)、高氟组(21.28%)较对照组凋亡率升高(P0.05),3-MA处理染氟成骨细胞后凋亡率增高,低氟+3-MA组(42.05%)增加最明显,高氟+3-MA组凋亡率(32.51%)增高(P0.05)。结论:1.过量氟可激活大鼠肝和骨组织中自噬LC3A、Beclin-1及凋亡因子Bcl-2、Bax,自噬和凋亡可能共同参与慢性氟中毒所致肝脏及成骨细胞损伤的发病过程。2.自噬与凋亡共同参与了氟对成骨细胞损伤的发生机制。
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本文编号：1470374
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