利拉鲁肽对糖尿病小鼠认知功能下降的作用及其分子机制研究

发布时间：2018-02-01 19:33

  本文关键词： 自噬 凋亡 糖尿病 认知功能 利拉鲁肽 自噬 凋亡 糖尿病 认知功能　出处：《浙江大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：糖尿病是一种以慢性高血糖为主要特征的代谢紊乱综合征,常伴有多尿多饮多食等临床表现,其发病率逐年上升,已成为一种严重影响人民健康的全球性公共卫生问题。糖尿病的慢性并发症遍及全身各大重要脏器,作为糖尿病一种严重但却容易被忽略的并发症,糖尿病相关认知功能下降已经逐渐引起人们的关注。但是,其潜在的发病机制及相应的临床干预措施仍不清楚。自噬在细胞的存亡中起着重要的作用,并且和很多神经退行性疾病相关。自噬是否参与了糖尿病相关认知功能下降,目前仍不清楚。鉴于糖尿病相关认知功能损害对患者生活质量的严重影响,研究其潜在的发病机制,有助于我们更好的了解这种疾病,从而寻找更有效的治疗措施和发现新的治疗靶点。近年来越来越多的研究报道了利拉鲁肽在各种实验动物模型和临床退行性疾病中的潜在神经保护作用。但是利拉鲁肽对糖尿病相关认知功能下降的作用尚不十分明确。本研究通过糖尿病动物在体模型和原代海马神经元离体培养,研究了糖尿病相关认知功能损伤的发病机制及其干预措施。我们的研究发现,糖尿病引起了海马神经元的损伤和之后的认知功能下降,而自噬参与其中,并起着一定的保护作用。此外,我们发现利拉鲁肽处理改善了糖尿病引起的神经元损伤和认知功能损害,同时,利拉鲁肽通过AMPK/mTOR信号通路进一步上调了自噬水平。因此,我们推测利拉鲁肽通过激活AMPK/mTOR信号通路上调自噬,从而改善糖尿病引起的认知功能下降。通过上述研究,我们揭示了利拉鲁肽在糖尿病相关认知功能下降中潜在的神经保护作用及其部分相关机制。本研究分为两个部分:第一部分:自噬在糖尿病引起的神经元损伤和认知功能下降中的作用;第二部分:利拉鲁肽通过激活AMPK/mTOR信号通路上调自噬改善糖尿病引起的认知功能下降。第一部分自噬在糖尿病引起的神经元损伤和认知功能下降中的作用目的:糖尿病是一种严重影响人民健康的全球性公共卫生问题,并且其患病率在全球范围内呈上升趋势。作为糖尿病一种严重但却容易被忽略的并发症,糖尿病相关认知功能下降已经逐渐引起人们的关注。但是,其潜在的发病机制仍不清楚。近年来越来越多的研究指出自噬在细胞的存亡中起着重要的作用,并且自噬和很多神经退行性疾病相关。在这部分研究中,我们通过离体和在体实验旨在研究自噬在糖尿病引起的神经元损伤和认知功能损害中的作用。方法:健康SPF级6周龄雄性小鼠,随机分为对照组(Con)和糖尿病组(DM),每组15只。我们通过链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)一次性腹腔注射制备糖尿病动物模型。糖尿病引起认知功能下降的研究:STZ诱导糖尿病模型成功后,定期监测小鼠血糖、体重、饮食量和饮水量;8 W后通过旷场实验和Morris水迷宫实验检测糖尿病动物认知功能的变化;通过HE染色观察神经元形态结构的改变;通过尼氏染色观察神经元数目的变化;通过透射电镜观察海马神经元突触和线粒体超微结构的改变;通过Western blot检测海马突触蛋白Synaptophysin和PSD95及凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax表达的改变。自噬在糖尿病诱导的神经元损伤中作用的研究:通过Western blot检测海马神经元自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62表达的变化;通过免疫荧光染色观察海马神经元自噬标记物LC3蛋白聚集的改变;通过透射电镜观察海马神经元自噬泡的改变;为了进一步探索自噬的作用,我们离体培养海马神经元,使用自噬抑制剂Bafilomycin A1人为阻断自噬后观察凋亡的变化。结果:STZ诱导糖尿病模型成功后,与Con组小鼠相比,DM组小鼠在实验过程中表现出了明显的代谢参数的改变:血糖明显升高、体重显著下降以及饮食量和饮水量明显增加(P0.05);认知功能的检测结果提示DM组小鼠的运动距离和游泳速度与Con组小鼠相比并没有表现出明显差异(P0.05),但是DM组小鼠的逃逸潜伏期明显长于Con组小鼠,平台跨越次数以及第三象限停留时间明显少于Con组小鼠,差异有统计学意义(P0.05);HE染色的结果表明,与Con组小鼠相比,DM组小鼠表现出了明显的神经元形态结构的改变:结构层次紊乱,神经元排列稀疏、不规则,细胞周围间隙增大,部分神经元变性坏死,细胞体积缩小;细胞核固缩成三角形或不规则形状,核仁淡染或消失;尼氏染色的结果指出DM组小鼠海马CA1区神经元密度明显低于Con组小鼠(PP0.05);透射电镜观察到DM组小鼠海马CA1区神经元明显的超微结构损害:突触数目减少、突触间隙增宽、突触后致密物质降低及突触小泡减少等,线粒体结构被破坏,混浊肿胀,线粒体嵴中断或消失;Western blot的结果提示,与Con组小鼠相比,DM 组小鼠 Synaptophysin 和 PSD95 的表达明显降低(P0.05),Cleaved caspase-3和Bax表达明显增加,Bcl-2表达显著减少(P0.05);与Con组小鼠相比,DM组小鼠的自噬水平显著上调,主要表现为:自噬标记物LC3-Ⅱ和自噬相关蛋白Beclin 1的蛋白表达明显增加,自噬底物蛋白p62的表达显著降低,LC3+NeuN双染阳性细胞数明显增多,自噬泡的形成明显增加(P0.05);而抑制自噬后,高糖处理引起的Cleaved caspase-3、Bax表达的增加和Bcl-2表达的降低这一趋势明显加剧(P0.05)。结论:在体动物模型证实糖尿病引起了神经元凋亡水平的增加,同时引起了海马神经元形态结构的破坏及神经元密度的降低,破坏了突触的超微结构,导致了突触结构和功能的损伤,上述因素共同作用引起了小鼠认知功能的下降。同时,在体实验表明糖尿病上调了海马神经元的自噬水平,而离体原代神经元培养结果进一步指出自噬在糖尿病诱导的神经元损伤中起着保护作用。第二部分利拉鲁肽通过激活AMPK/mTOR信号通路上调自噬改善糖尿病引起的认知功能下降目的:糖尿病相关认知功能下降作为糖尿病的一种慢性并发症,严重影响了患者的生活质量,增加了患者的经济负担,引起了人们的广泛关注。然而,相应的临床干预和处理却很少。利拉鲁肽是一种胰高糖素样多肽1(Glucagon-like peptide 1,GLP-1)类似物,其可根据机体内葡萄糖水平的高低,按需促进胰岛β细胞分泌胰岛素,从而有效调节血糖。近年来,越来越多的研究报道了利拉鲁肽的胰外作用,其中神经保护作用备受关注。在这部分实验中,我们主要探索利拉鲁肽能否改善糖尿病引起的神经元损伤和认知功能损害,同时结合第一部分实验结果,初步探索其相关机制。方法:健康SPF级6周龄雄性小鼠,随机分为对照组(Con)、糖尿病组(DM)和DM+利拉鲁肽组(DM+LRG),每组15只。STZ诱导糖尿病动物模型成功后,利拉鲁肽处理8周。利拉鲁肽对糖尿病引起认知功能下降的作用研究:药物处理期间定期监测小鼠血糖、体重、饮食量和饮水量;8 W后通过旷场实验和Morris水迷宫实验检测糖尿病动物认知功能的变化;通过HE染色和尼氏染色观察神经元形态结构和数目的改变;通过透射电镜观察海马神经元突触超微结构的变化;通过Western blot检测海马Cleaved caspase-3蛋白表达的改变。利拉鲁肽神经保护作用的机制研究:通过Western blot和Real-time RT-PCR检测海马神经元自噬相关基因Atg12、Atg5、LC3、Beclin 1和p62表达的变化;通过免疫荧光染色观察海马神经元自噬标记物LC3蛋白聚集的改变;为了进一步研究其相关机制,我们采用离体模型-海马原代神经元培养,使用AMPK特异性抑制剂Compound C阻断相关信号通路后观察自噬的变化。结果:糖尿病造模成功后,DM组小鼠表现出了高血糖、低体重、多饮多食等典型的糖尿病代谢特点,而连续注射利拉鲁肽后,与DM组小鼠相比,DM+LRG组小鼠并没有表现出明显的上述代谢指标的改善(P0.05);认知功能检测结果表明与DM组小鼠比较,DM+LRG组小鼠的逃逸潜伏期明显降低,平台穿越次数和第三象限停留时间显著增加,差异有统计学意义(P0.05);形态学的检查结果显示利拉鲁肽处理明显减轻了 DM组小鼠海马CA1区神经元形态结构的破坏和神经元密度的降低,同时改善了突触超微结构的损伤;Western blot结果表明与DM组小鼠比较,DM+LRG组小鼠的促凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表达明显下降(P0.05);与Con组小鼠相比,DM组小鼠和DM+LRG组小鼠的自噬水平都有所上调,主要表现为:自噬相关基因Atg12、Atg5、LC3、Beclin 1 mRNA水平的增加和p62mRNA水平的下降、LC3、Beclin1蛋白表达的增加和p62蛋白表达的下降以及LC3+NeuN双染阳性细胞数的增加(P0.05),而与DM组小鼠比较,DM+LRG组小鼠的上述改变更加明显(P0.05);原代神经元培养的结果提示,利拉鲁肽处理进一步上调了海马原代神经元的自噬水平,而使用AMPK抑制剂Compound C之后,部分逆转了这种趋势(P0.05)。结论:利拉鲁肽处理降低了糖尿病引起的海马神经元凋亡,改善了糖尿病引起的神经元形态结构损伤和神经元密度降低,减轻了突触超微结构的破坏,进而改善了糖尿病引起的认知功能下降。同时,利拉鲁肽进一步上调了自噬水平,AMPK/mTOR信号通路参与其中,而自噬在糖尿病引起的神经元损伤中起着保护作用。因此,我们可以推测利拉鲁肽通过激活AMPK/mTOR信号通路上调自噬,改善了糖尿病引起的认知功能下降。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R749.2

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