自噬在成骨细胞氧化应激中的作用及其与骨质疏松的关系研究

发布时间：2018-02-06 01:01

  本文关键词： 骨质疏松 氧化应激 自噬 骨细胞 骨质疏松 氧化应激 自噬 凋亡 内质网应激 骨质疏松 BECN-1 自噬 增殖 凋亡 分化　出处：《上海交通大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分骨质疏松骨组织中骨细胞自噬增加及其与氧化应激和骨量的关系目的：探讨骨质疏松大鼠骨组织中骨细胞是否存在自噬,以及与氧化应激的关系。方法：通过去卵巢建立骨质疏松大鼠模型,将36只6周龄SD大鼠随机分为假手术组,去卵巢组(Ovx组)和去卵巢加雌激素治疗组(OVX+E2)。6周后,通过micro-CT和DEXA检测骨微细结构和骨量,透射电镜观察骨细胞胞浆内自噬体以及细胞器的变化,免疫荧光法、Western blot和qRT-PCR检测自噬特异性基因BECN-1、p62/SQSTM1以及Mapl-LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达。并通过ELISA检测血浆内雌激素水平、骨组织内T-AOC、SOD、CAT等抗氧化酶活性。此外,分析自噬与氧化应激的相关性。结果：骨质疏松模型大鼠骨细胞,透射电镜下细胞胞浆内可见较多环状结构物质,该物质有自噬体特异性的双层膜结构,同时Western blot检测自噬相关基因p62/SQSTM1、BECN-1以及Mapl-LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达增加。免疫荧光检测结果显示,骨质疏松动物模型骨细胞胞浆内Mapl-LC3蛋白的表达明显增高；而骨组织内抗氧化酶活性明显下降,提示在此过程中细胞自噬与抗氧化酶相关。结论：骨质疏松模型大鼠骨细胞自噬增强,且与氧化应激相关,但自噬与氧化应激的关系有待进一步实验明确。第二部分内质网应激介导自噬减轻成骨细胞氧化应激损伤目的：氧化应激诱导成骨细胞凋亡在骨质疏松病理过程中起重要作用,但自噬在成骨细胞氧化应激、凋亡中的作用尚未明确。本项研究的目的在于观察自噬对成骨细胞氧化应激损伤中的作用,并借此观察细胞自噬与凋亡之间的关系。方法：给予不同浓度(0.1、1、10 mM)过氧化氢(H202)刺激Mc3T3-E1细胞；在不同时间(0、2、6、8、12h),采用透射电镜观察自噬体,MDC和LysoTracker染色检测细胞内的自噬溶酶体活性,Western blot检测自噬相关蛋白BECN-1、 Mapl-LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达变化,DCFH-DA荧光染色检测细胞内的ROS水平；Annexin V/PI检测细胞凋亡率；应用Rap,3-MA和Baf-A1自噬调节剂观察细胞内的ROS水平,以明确自噬和凋亡之间的相互影响。Western blot检测内质网应激相关蛋白表达变化,包括p-PERK、PERK、IRE1、PDI、GRP-78蛋白表达变化。随后应用Talen技术敲除PERK、IRE1和GRP-78基因后,检测细胞自噬变化,明确内质应激与自噬的关系。最后,分别应用GFP-LC3标记自噬体,RFP标记线粒体,免疫荧光定位在氧化应激条件下Mc3T3-E1细胞线粒体和自噬体位置分布变化,以明确线粒体损伤与自噬的关系。结果：过氧化氢诱导成骨细胞的凋亡和自噬,呈剂量和时间依赖性；自噬抑制剂(3-MA,Baf-A1)可显著增强过氧化氢诱导的细胞内ROS水平及凋亡率,Western blot证实cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白增加；自噬诱导剂(Rap)部分抑制氧化氢诱导氧化应激和凋亡；氧化应激诱导线粒体膜电位下降,线粒体细胞色素C等释放增加。在过氧化氢处理2小时后,免疫荧光共定位显示线粒体和自噬体的重叠度为23%。此外,过氧化氢诱导内质网应激,阻断内质网关键信号分子GRP-78或者PERK,导致细胞自噬受阻,凋亡增加。结论：通过内质网途径,自噬减轻成骨细胞氧化应激。自噬抑制氧化应激介导的凋亡,自噬是骨质疏松治疗潜在的靶点。第三部分BECN-1基因对MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和凋亡的影响目的：自噬抑制成骨细胞氧化应激,但具体机制尚不清楚。BECN-1是自噬关键调控基因,研究证实BECN-1在衰老,骨关节炎等退变性疾病过程中的发挥重要作用。然而,BECN-1在骨质疏松和骨形成中的作用尚不清楚。本项研究的目的在于观察BECN-1基因对成骨细胞增殖、分化和凋亡的影响。方法：应用慢病毒(pGC-FU-3FLAG-BECN-1)和Talen技术分别构建过表达和干扰BECN-1基因载体,建立BECN-1过表达和沉默细胞系；CCK-8检测成骨细胞增殖率；流式检测BECN-1基因过表达和沉默对细胞周期影响；成骨诱导分化4周,茜素红染色检测成骨细胞矿化能力；成骨诱导分化48hrs,qRT-PCR和western blot检测成骨分化相关Runx2、OCN、COL-1基因和蛋白的表达水平：最后,Annexin V-PE/7AAD染色流式细胞检测BECN-1基因对成骨细胞凋亡的影响。结果：成功构建稳定BECN-1过表达和沉默的Mc3T3-E1细胞系；CCK-8检测结果显示：BECN-1基因沉默导致细胞增殖受抑制,但是BECN-1过表达细胞增殖能力无明显改变；流式检测细胞周期结果显示BECN-1过表达细胞无明显变化,BECN-1基因沉默导致细胞周期停滞于S期；成骨诱导分化4周,BECN-1基因沉默细胞矿化结节数量明显减少,而BECN-1过表达不影响细胞矿化能力；成骨诱导分化48 hrs,qRT-PCR和western blot检测结果示BECN-1基因沉默抑制Runx2、OCN、COL-1基因和蛋白的表达,而BECN-1过表达对成骨分化相关基因表达影响不明显。过氧化氢处理12 hrs,BECN-1基因沉默导致细胞更易受过氧化氢损伤,成骨细胞凋亡率升高,而BECN-1过表达则抑制成骨细胞凋亡。结论：自噬基因BECN-1沉默导致成骨细胞增殖和分化受抑制,同时BECN-1基因沉默导致细胞更易受氧化应激损害,凋亡增加。而BECN-1过表达则增强成骨细胞抗氧化能力,凋亡减少。BECN-1可能是骨质疏松抗氧化治疗的有效靶点。
[Abstract]:The effects of autophagy on oxidative stress and oxidative stress in bone tissue were investigated by means of micro - CT and DEXA . The effects of BECN - 1 gene on proliferation , differentiation and apoptosis of MC3T3 - E1 cells were studied . The results showed that BECN - 1 gene silencing resulted in the inhibition of proliferation and differentiation of osteoblasts , but BECN - 1 overexpression did not affect cell mineralization .

【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R580

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本文编号：1493202