Mst1在糖尿病心肌微血管损伤中的作用及机制研究

发布时间：2018-02-13 03:31

  本文关键词： 糖尿病心肌病 心肌微血管内皮细胞 Mst1 自噬　出处：《第四军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：根据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation,IDF)统计数据显示,截止至2015年,在全球范围内,糖尿病患者数量总计为4.15亿人,糖尿病前期患者数量为3.18亿人。根据目前每年增长的速度来预计,如果不施以任何干预措施,至2040年,糖尿病患者数量总计将会达到6.42亿人,而糖尿病前期人群数将达到4.81亿人。近三十年来,我国糖尿病的患病率增加了17倍,从总人口数的0.67%增长至11.6%。心血管(Cardiovascular,CV)并发症在糖尿病患者的发病率和死亡率中占相当大的比例。糖尿病心血管损伤的特点是内皮功能发生障碍。内皮是心血管系统的一个重要组成部分,它影响着微血管功能的许多方面,包括压力、流量、渗透率、血管生成和血流变。糖尿病的血管内皮发生功能障碍会导致微血管病的相应临床表现。然而,鲜为人知的是,与糖尿病相关的冠状动脉微血管损伤的机制。因此,更好地了解糖尿病的发病机制和预防冠状动脉微血管损伤是糖尿病管理中的核心问题。内皮细胞作为葡萄糖和心肌细胞之间的屏障,在糖尿病相关的心血管疾病的发病机制中起着重要的作用。在最近的研究中,自噬成为心血管疾病治疗的一个潜在的新靶点,也有文献证明了在防止糖尿病引起的肾小球硬化方面,内皮细胞和足细胞的自噬作用。然而,目前还没有研究表明心肌微血管内皮细胞自噬在糖尿病中的作用。Mst1(哺乳动物STE20样激酶1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,具有不同的生物功能,包括细胞自噬、凋亡和氧化应激。据文献报道,在心肌梗死小鼠模型中,Mst1通过抑制自噬来促进心脏功能障碍的发展。此外,我们的研究也表明,通过抑制Mst1基因能够上调自噬,从而减轻梗死后心脏功能障碍。在心脏中,Mst1广泛分布于心肌细胞和内皮细胞。Mst1基因可以直接抑制Beclin1活性,然而,Mst1/Beclin1信号通路在糖尿病冠状动脉微血管损伤发展的直接作用机制并不清楚。综上所述,本研究分别从整体动物和细胞水平探讨自噬在糖尿病心肌微血管损伤中的作用以及Mst1/Beclin1信号通路在其损伤中的作用,为糖尿病心肌病变的诊治提供新的思路。【目的】1.构建转基因小鼠糖尿病模型,分别观察Mst1基因敲除和Mst1基因过表达的糖尿病小鼠心脏功能以及心肌微血管损伤情况。2.分离培养心肌微血管内皮细胞,分别利用携带有Mst1 shRNA的腺病毒和Mst1的腺病毒干预细胞,观察高糖条件下其对心肌微血管内皮细胞自噬水平的影响。3.明确自噬在糖尿病心肌微血管损伤中的作用,证实Mst1/Beclin1信号通路介导的自噬在高糖诱导心肌微血管内皮细胞损伤中的作用。【研究方法】1.将C57和Mst1-/-小鼠随机分为四组:正常C57小鼠组(WT),Mst1基因敲除小鼠组(Mst1-/-),糖尿病小鼠组(DM),糖尿病Mst1基因敲除小鼠组(DM+Mst1-/-)。2.将非转基因小鼠和Mst1转基因小鼠随机分为四组:非转基因小鼠组(NTg),Mst1转基因小鼠组(Tg-Mst1),糖尿病非转基因小鼠组(DM+NTg),糖尿病Mst1转基因小鼠组(DM+NTg)。3.按照50 mg/kg/d的标准构建糖尿病小鼠模型,链脲佐菌素(STZ)腹腔注射。造模成功后,继续饲养12周。4.于12周末,超声检测各组小鼠心脏功能;扫描电镜观察各组小鼠心肌微血管连接的完整性(血管铸型实验)。5.分离培养心肌微血管内皮细胞,利用携带有Mst1 sh RNA(MOI:100)的腺病毒对细胞进行转染,随机分为以下6组:A.对照组(5.5 mmol/L葡萄糖):Con;B.对照组(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Lac Z;C.Mst1下调组(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Ad-sh-Mst1;D.高糖对照组(33 mmol/L葡萄糖):HG;E.高糖对照组(33 mmol/L葡萄糖):HG+Lac Z;F.高糖Mst1下调组(33 mmol/L葡萄糖):HG+Ad-sh-Mst1。6.分离培养心肌微血管内皮细胞,利用携带有Mst1(Ad-Mst1)(MOI:100)的腺病毒对细胞进行转染,随机分为以下6组:A.对照组(5.5 mmol/L葡萄糖):Con;B.对照组(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Ad-Control;C.Mst1上调组(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Ad-Mst1;D.高糖对照组(33 mmol/L葡萄糖):HG;E.高糖对照组(33 mmol/L葡萄糖):HG+Ad-Control;F.高糖Mst1上调组(33 mmol/L葡萄糖):HG+Ad-Mst1。7.Western blotting法检测腺病毒转染细胞后的Mst1基因表达水平。8.心肌微血管内皮细胞中GFP-LC3的免疫荧光检测。9.心肌微血管内皮细胞中p62/aggresome的免疫荧光检测。10.透射电镜观察心肌微血管内皮细胞中自噬小体的形态及数量。11.TUNEL法检测心肌微血管内皮细胞的凋亡。12.JC-1染色检测心肌微血管内皮细胞中线粒体膜电位水平。13.Western blotting法检测心肌微血管内皮细胞中sirt1、Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白分子表达水平。【研究结果】1.Mst1基因敲除(Mst1-/-)能够改善糖尿病小鼠的心功能障碍,能够改善糖尿病小鼠心肌微血管内皮连接的完整性。2.过表达Mst1基因能够加重糖尿病小鼠的心脏功能障碍,能够加重糖尿病小鼠心肌微血管内皮连接完整性的破坏。3.Mst1基因敲除可以上调心肌微血管内皮细胞的自噬水平,降低p62/aggresome的聚集,促进细胞自噬小体的生成,抑制高糖培养下心肌微血管内皮细胞的凋亡,并且能够改善心肌微血管内皮细胞的线粒体膜电位水平。4.过表达Mst1基因可以下调心肌微血管内皮细胞中LC3的表达,增加细胞中p62/aggresome的聚集,抑制细胞中自噬小体的生成,增加高糖培养下细胞的凋亡水平,并且能降低心肌微血管内皮细胞的线粒体膜电位水平。5.Western结果显示:Mst1基因的下调可以使sirt1和Beclin1蛋白的表达显著增多;可以促进LC3-Ⅱ表达,抑制p62表达;可以引起自噬流的增强,BAF中LC3-II/LC3-1比值增加,p62表达降低。6.Western结果显示:Mst1基因的上调可以抑制sirt1和Beclin1蛋白的表达;可以抑制LC3-Ⅱ表达,促进p62表达;可以抑制自噬流,BAF中LC3-II/LC3-1比值减少,p62表达增多。【结论】通过本实验,我们成功构建了转基因小鼠糖尿病模型并分离培养出了小鼠心肌微血管内皮细胞,发现了Mst1基因敲除能减轻糖尿病导致的心功能障碍,减轻心肌微血管的病理损伤,增加心肌的自噬水平;Mst1过表达可以加重糖尿病导致的心功能障碍,加重心肌微血管的病理损伤,降低心肌的自噬水平,其机制可能是通过Mst1/Beclin1信号通路发挥作用,为糖尿病心肌病变的诊治提供新的思路。
[Abstract]:鏍规嵁鍥介檯绯栧翱鐥呰仈鐩，

本文编号：1507228