系统性红斑狼疮中RasGRP3通过调节Ras信号通路活化影响B细胞分泌细胞因子及凋亡

发布时间：2018-02-14 12:57

  本文关键词： siRNA RasGRP3 B淋巴细胞 p-Erk p-Akt B细胞 RasGRP3 IL-6 TNFa caspase3　出处：《华中科技大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分 干扰正常人外周血B细胞和系统性红斑狼疮鼠MZ FO B细胞中RasGRP3的表达对下游信号通路的影响 目的系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种典型的自身免疫性疾病,其特点是自身免疫耐受缺失产生大量自身抗体导致多器官功能受损。内源性自身反应性B淋巴细胞是SLE发病的重要环节,其发病机制之一B细胞受体(B cell receptor, BCR)通路的高度活化。Ras鸟苷酸释放蛋白3(Rasguanylnucleotide releasing protein3, RasGRP3)作为BCR信号通路下游重要分子主要在B细胞中表达。在前期实验中我们已证明系统性红斑狼疮患者PBMC及B细胞中RasGRP3的mRNA和蛋白质水平均较正常人明显升高,提示RasGRP3在PBMC及B细胞中的异常表达可能参与狼疮发病。本实验用siRNA干扰RasGRP3在正常人外周血B细胞及狼疮鼠MZ FO B细胞中的表达,研究RasGRP3的表达水平对下游信号通路活化的影响,探讨RasGRP3参与系统性红斑狼疮发病的机制。 方法收集正常志愿者外周血3例及MRL/1pr.B6狼疮鼠脾脏3例。分别通过Ficoll法及研磨法提取正常人PBMC及MRL/1pr.B6狼疮鼠脾脏细胞,然后采用磁珠分选法纯化B细胞。通过电转染使siRNA干扰B细胞。T通过逆转录PCR方法和Western Blot方法检测RasGRP3在正常人B细胞和狼疮鼠脾脏MZFOB细胞中的mRNA及蛋白的表达。siRNA干扰细胞40h后,使用anti-IgM, CD40L和人重组IL-4刺激人外周血B细胞,anti-IgM, anti-CD40和鼠重组IL-4刺激狼疮鼠MZFOB细胞,在刺激时间为0min和30min时提取细胞。通过western blot方法检测RasGRP3蛋白水平和下游信号分子Erk, Akt以及各蛋白分子磷酸化的水平。 结果无论是正常人B细胞还是狼疮鼠MZ FO B细胞,siRNA干扰后细胞中RasGRP3mRNA和蛋白的表达均叫显低于scramble组。刺激30min后,RasGRP3siRNA组Erk, Akt磷酸化水平明显低于Scramble siRNA组。 结论通过电转染的方法可以使siRNA成功干扰正常人B细胞及狼疮鼠MZ FO B细胞中RasGRP3mRNA和蛋白质的表达。正常人外周血B细胞及狼疮鼠MZ FOB细胞中RasGRP3表达水平降低可以下调其下游信号分子Erk和Akt磷酸化水平,这也许是RasGRP3参与系统性红斑狼疮发病的机制之一 第二部分 干扰系统性红斑狼疮鼠MZFOB细胞中RasGRP3的表达对分泌炎性细胞因子及细胞凋亡的影响 目的研究沉默RasGRP3后MRL/1pr.B6良疮鼠MZFOB细胞分泌细胞因子及表达凋亡蛋白的情况,进一步探讨RasGRP3参与系统性红斑狼疮的发病机制。 方法收集MRL/1pr.B6狼疮鼠脾脏3例。通过研磨法提取狼疮鼠脾脏细胞,然后采用磁珠分选纯化狼疮鼠脾脏MZ FO B细胞。通过电转染siRNA法干扰狼疮鼠脾脏MZFOB细胞RasGRP3的表达。细胞电转染20h后用anti-IgM, anti-CD40和鼠重组IL-4刺激狼疮鼠MZ FO B细胞,在刺激时间为0h和6h时提取细胞。使用realtime PCR方法检测MZ FO B细胞内IL-6及TNFa的mRNA水平。细胞电转染40小时后提取细胞,用western blot法明确凋亡蛋白caspase3及cleaved caspase3活化片段的表达。 结果刺激6h后较刺激前MZ FO B细胞内IL-6和TNFa的mRNA表达明显升高,但RasGRP3siRNA组MZFOB细胞内IL-6和TNFa的mRNA明显低于scramble组。siRNA干扰40h后siRNA组MZ FO B细胞caspase3活化片段的表达明显高于scramble组。 结论RasGRP3表达降低导致狼疮鼠MZFOB细胞内促炎性因子IL-6和TNFa的mRNA水平降低,同时增加细胞内凋亡蛋白的表达。由此提示RasGRP3可以抑制B细胞分泌炎性细胞因子并促进B细胞凋亡,从而参与狼疮的发生。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.241

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1 夏颖;系统性红斑狼疮中RasGRP3通过调节Ras信号通路活化影响B细胞分泌细胞因子及凋亡[D];华中科技大学;2015年

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本文编号：1510755