氟作用下OB钙稳态变化机制探讨及L型钙通道角色研究

发布时间：2018-02-22 02:49

  本文关键词： 氟 成骨细胞 钙稳态 钙通道 钙泵 硝苯地平　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： 成骨活跃和骨转换加速是形成氟骨症多种骨骼改变的病理基础，其中成骨细胞（osteoblast, OB）功能活跃在慢性氟中毒的骨损害中发生较早，是起着主导作用的环节，而OB Ca2＋浓度升高可能是氟激活OB的启动机制之一。因此，研究氟作用条件下OB的Ca2+稳态变化在氟中毒发生机制研究中非常必要。迄今有关这方面尚缺乏系统的研究，，OB内Ca2+浓度升高在氟骨症各种骨病变发生中的作用也还不十分清楚。本研究拟通过体内、体外实验，通过观察氟作用下OB及大鼠骨组织L型钙通道(Cav1.2)、钙泵（PMCA，NCS）及内质网膜IP3受体通道(IP3R)、钙泵（SERCAs）变化，研究氟作用条件下OB Ca2+稳态变化的机制；此外，将L型钙通道特异性拮抗剂硝苯地平作为干预手段，从mRNA水平、蛋白水平检测硝苯地平干预前后OB Cav1.2、成骨相关转录因子（c-fos, c-jun,runt-related transcription factor2(Runx2), osterix (OSX)）水平，从而阐明OB内Ca2+升高在氟骨症骨病变发生中的作用，同时探讨L型钙通道在氟作用下OB钙稳态维持中的角色，试图为氟骨症发生机制研究提供科学依据，为氟骨症的防治策略提供新靶点、新思路、新方法。 方法： 不同浓度氟(0、2、5、10mg/L F-)处理OB细胞株（MC3T3-E1细胞）48小时，以及SD大鼠饮水摄氟(100mg/L F-)2个月，通过实时定量PCR和Western-Blot检测细胞、大鼠骨组织Cav1.2、NCS、PMCA、IP3R、SERCA2b mRNA、蛋白表达水平，共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度(intracellular free calcium ion，[Ca2+]i)。此外，将不同氟浓度条件液(0、2、5、10mg/L)及L型钙通道拮抗剂硝苯地平(10μM)共同作用于MC3T3-E1细胞48小时，随后通过实时定量PCR和Western-blot检测Cav1.2，c-fos, c-jun, Runx2, OSX及共聚焦显微镜检测[Ca2+]i。 结果： 1.通过观察氟作用下OB细胞内钙离子浓度变化及质膜、内质网膜上钙通道、钙泵的表达水平，我们发现： 1）氟作用下OB内钙离子浓度明显升高，且呈浓度依赖性； 2）体外实验结果示：低氟浓度下(F5组,特别是F2组)，OB Cav1.2、NCS-1mRNA和蛋白水平均明显升高(P0.05)，IP3R mRNA和蛋白水平明显降低(P0.05)，ATP2A2mRNA和蛋白水平降低(P0.05)；高氟浓度下(F10组)，OBCav1.2、NCS-1mRNA和蛋白水平均明显减少(P0.05)，IP3R mRNA和蛋白水平降低(P0.05)，但较低氟作用下表达增多(P0.05)，ATP2A2mRNA和蛋白水平增加(P0.05)，SERCA2b mRNA水平亦明显升高(P0.05)。换言之，与C组相比，F2组[Ca2+]i浓度、Cav1.2、NCS-1表达都增加，而IP3R和ATP2A2表达水平降低；F10组[Ca2+]i浓度、ATP2A2、SERCA2b表达增加，而Cav1.2、NCS-1和IP3R表达降低； 3）体内实验结果示：低氟浓度下(2组)，骨组织Cav1.2、NCS-1mRNA和蛋白水平均明显升高(P0.05)，PMCA蛋白水平明显升高(P0.05)，骨组织ATP2A2mRNA和蛋白水平降低(P0.05)；高氟浓度下(4组)，骨组织Cav1.2、NCS-1mRNA和蛋白水平均明显减少(P0.05)，PMCA蛋白水平明显减少(P0.01)，骨组织ATP2A2mRNA和蛋白水平增加(P0.05)。换言之，与体内实验1组相比，2组Cav1.2、NCS-1和PMCA表达都增加，而ATP2A2表达水平降低；4组Cav1.2、NCS-1和PMCA表达降低，而ATP2A2表达增加。 2.通过探讨L型钙通道在氟作用下OB钙稳态维持中的角色，结果显示： 1）[Ca2+] i的水平以剂量依赖的方式随着氟化物浓度的增加而增加； 2）低氟条件下，OB的Cav1.2mRNA和蛋白表达增加；高氟条件下，OB的Cav1.2mRNA和蛋白表达较少；加入硝苯地平后上述改变发生显著变化； 3）低氟条件下，OB的转录因子c-fos和c-jun mRNA和蛋白表达增加；高氟条件下，OB的转录因子c-fos和c-jun mRNA和蛋白表达减少；加入硝苯地平后上述趋势发生显著变化； 4）低氟条件下，OB的Runx2和OSX mRNA和蛋白表达增加；高氟条件下，OB的Runx2和OSX mRNA和蛋白表达轻度升高或减少；加入硝苯地平后上述改变发生明显变化。 结论： 1.氟作用下OB内钙离子浓度升高，且呈浓度依赖性； 2.在低氟浓度下，OB内钙离子增多主要由于细胞膜钙离子通道开放所致，并通过质膜上的钙泵NCS、PMCA向胞外排放钙离子以维持细胞内钙稳态； 3.在高氟浓度下，OB膜内流及外排钙离子减少，ER通过IP3R向胞内排放钙离子较低氟时增加，细胞内超载的钙离子主要通过ER膜上的钙泵ATP2A2、SERCA2b从胞内摄取钙离子以维持细胞内钙稳态； 4.氟作用下的OB通过调节Cav1.2、NCS-1、PMCA、IP3R、SERCA2b/ATP2A2表达维持细胞内钙稳态，质膜及内质网膜上的钙通道、钙泵在氟作用下OB钙稳态变化中发挥重要作用； 5.低氟浓度（5mg/l，特别是2mg/l）下，OB Cav1.2、c-fos、c-jun、Runx2、OSX表达增加，成骨作用增强；而高氟浓度（102mg/l）下Cav1.2、c-fos、c-jun、Runx2、OSX表达相对减少，成骨作用相对减弱； 6.硝苯地平干预后，氟作用下OB [Ca2+] i的水平、Cav1.2、c-fos、c-jun、Runx2、OSX表达显著改变，甚至发生逆转； 7.氟通过L型钙通道影响OB钙稳态及成骨转录因子的表达，使OB成骨功能活跃，从而启动氟骨症进程。
[Abstract]:Objective:
Active osteogenesis and bone turnover accelerated is the formation of pathological basis of skeletal fluorosis of various skeletal changes, including osteoblasts (osteoblast, OB) occurred earlier in the active function of bone damage in chronic fluorine poisoning, is plays a leading role in the link, OB and Ca2 + concentration may be one of the starting mechanism of fluoride activation of OB therefore, the change of OB Ca2+ steady state conditions in effect of fluoride fluoride poisoning on the mechanism is necessary. So far this is still a lack of systematic research, the concentration of Ca2+ in OB increased the role of changes in various bone diseases of skeletal fluorosis were not clear. This study by in vivo, in vitro experiments. By observing the effect of fluoride bone tissue and rat OB L type calcium channel (Cav1.2), calcium pump (PMCA, NCS) and the endoplasmic reticulum of IP3 receptor (IP3R), calcium pump (SERCAs) mechanism of OB Ca2+ steady state changes, changes of fluorine conditions; in addition, L Type calcium channel antagonist nifedipine as a means of intervention in the level of mRNA and protein levels before and after nifedipine intervention of OB Cav1.2, osteogenic transcription factor (c-fos, c-jun, runt-related transcription FACTOR2 (Runx2), osterix (OSX)), and clarify the elevation of OB Ca2+ in the occurrence of fluorosis of bone lesions. At the same time, to explore the role of L type calcium channel to maintain calcium homeostasis in OB under the action of fluoride in the attempt to provide a scientific basis for the pathogenesis of chronic fluorosis research for fluorosis prevention strategy to provide a new target, new ideas and new methods.
Method锛

本文编号：1523465