BIV及MVV Vif降解宿主蛋白APOBEC3Z2-Z3的机制研究以及嵌合型stHIV-1的构建

发布时间：2018-03-09 09:41

本文选题：BIV　切入点：Vif　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：引发宿主重大疾病的许多病原体，包括HIV病毒在内，在长期进化过程中衍生出一系列拮抗宿主细胞内抗病毒因子的辅助感染蛋白，从而完成病毒在宿主体内的高效复制。另一方面，在HIV-1感染人类细胞过程中，宿主自身产生一类通过不同途径发挥抗病毒功能的蛋白，这类蛋白称为宿主限制因子。病毒辅助蛋白与宿主限制因子之间的相互作用机制研究是获得性免疫缺陷综合症研究领域的热点问题。现阶段已经被阐明的病毒辅助蛋白与宿主限制因子的作用机制包括：1.HIV-1的病毒感染因子Vif和宿主限制因子APOBEC3G；2.HIV-1的衣壳蛋白(capsid)与宿主限制因子TRIM5α；3.HIV-1的功能蛋白Vpu与宿主限制因子Tetherin(BST-2)；4.HIV-2附属蛋白Vpx与宿主限制因子SAMHD1。病毒辅助蛋白和宿主限制因子之间的相互作用存在种属特异性，主要表现为病毒辅助蛋白的跨种属活性以及宿主限制因子的广谱抗病毒活性。一方面，某些不能感染人类的病原体在长期进化过程中，产生能有效拮抗人类宿主限制因子的辅助蛋白，使病毒感染的种属范围扩大，从而产生了近些年来大量爆发的人畜共患病。因此对于其他种属的宿主限制因子与病毒蛋白的相互作用机制的研究可为防治人畜共患病研究领域提供理论依据。另一方面，病毒感染宿主范围的限制，导致药物开发中动物模型选择的局限性。HIV-1在非人类细胞中的感染力会被其他种属细胞内的同源宿主限制因子大大削弱，致使HIV-1病毒不能感染其他种属，比如非人灵长类动物。从而衍生出针对HIV-1病毒改造，使其能够在猴体内长期复制的研究领域。在本论文中，我们以宿主限制因子与病毒辅助蛋白的相互作用机制为出发点，围绕上述两方面内容进行讨论。本论文的第一部分是围绕宿主限制因子APOBEC3蛋白在其他种属中与其对应的慢病毒Vif蛋白的作用机制展开研究。慢病毒（lentiviruses）是逆转录病毒的一个亚家族，由于这种病毒在宿主体内会产生一个长的疾病潜伏期而得名。其中研究最多的是人类免疫缺陷病毒HumanImmunodeficiency Virus, HIV）和猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV），另外还有猫免疫缺陷病毒（Feline Immunodefiency Virus, FIV）以及一些感染偶蹄类动物的病毒包括牛免疫缺陷病毒（Bovineimmunodeficiencyvirus,BIV），绵羊梅迪-维斯那病毒（Maedi-visnavirus，MVV）以及马传染性贫血病毒（equineinfectious anemiavirus，EIAV)等。对于除EIAV之外的慢病毒，Vif蛋白都是与病毒感染、复制相关的重要辅助因子。其中HIV, SIV, FIV的Vif蛋白对相应宿主限制因子A3s蛋白的降解作用机制已经被广泛的研究，Vif蛋白通过招募ElonginB，ElonginC，Cullin5形成E3泛素连接酶复合物降解相应宿主的APOBEC3蛋白。但是BIV以及MVV的Vif对相应的宿主A3s蛋白的降解作用机制尚未被揭示。本论文对BIV以及MVV Vif介导的相应宿主APOBEC3蛋白的降解机制进行了研究。研究发现BIV以及MVV Vif介导的降解机制与已被阐述的HIV-1, SIV以及FIV Vif介导的降解机制既存在共同性又存在一定的不同之处：BIV以及MVV Vif同样是通过蛋白酶体途径降解宿主A3蛋白；BIV以及MVVVif中都存在对降解作用至关重要的与ElonginC结合的BC-Box。但它们所招募的E3连接酶复合物成员不完全相同：BIV Vif降解复合物成员包括ElonginB, ElonginC以及Cullin2，MVV Vif降解复合物成员包括ElonginB, ElonginC以及Cullin5，BIV以及MVV Vif介导的降解均不依赖CBF-β；与其他慢病毒的Vif蛋白在形成E3复合物中对Cullin蛋白的选择性不同， BIV Vif是唯一一个招募Cullin2蛋白的。锌离子螯合剂TPEN能够阻断BIV Vif对APOBEC3蛋白的降解，说明Zn2+对BIV Vif的活性有重要意义。通过序列比对以及点突变的方法我们证实了BIV Vif上与btCullin2之间相互作用的关键位点为C-x1-C-x1-H-x19-C基序。锌亲和层析实验表明BIV Vif与Zn2+间的相互结合依赖于C-x1-C-x1-H-x19-C基序，它是与以往报道的Zn指结构都不尽相同的一个全新的Zn2+结合环。MVVVif虽与Cullin5相结合，但在MVVVif上未发现Cul5-box或HCCH基序，并且MVV Vif对宿主APOBEC3蛋白的降解几乎不受TPEN的影响，说明MVV Vif介导的降解不依赖Zn2+的参与，这些都暗示MVV Vif与oaCul5之间的相互作用方式不同于HIV-1或SIV Vif。本论文的第二部分内容是利用宿主限制因子的种属特异性，对病毒进行改造，试图突破种属间传播的限制瓶颈。1981年艾滋病发现至今短短30余年时间里，全球已有超过3400万人感染艾滋病。然而没有合适的动物模型是阻碍艾滋病药物与疫苗开发的关键因素之一。现阶段用于研究艾滋病的动物模型有两种：一种是HIV-1感染黑猩猩和SCID/hu鼠，但是它们的有效性和疾病特征严重限制了其应用。另一种是用猴免疫缺陷病毒SIV或经改造的SHIV感染恒河猴，尽管这种动物模型对于研究发病机理很有效，但由于SIV与HIV之间的差异，致使这种感染不能完全模拟HIV对人类的感染。因此该动物模型对于艾滋病治疗药物以及疫苗的评价存在一定的缺陷。那么，构建更加完善的用于评价艾滋病疫苗或药物的动物模型将有助于推动全球艾滋病的治疗。猴分为两大种类：一种是新世界猴，如松鼠猴和通常的绒猴；另外一种是旧世界猴，如非洲绿猴（African green monkey, agm）和恒河猴（Rhesus Macacus, mac）。HIV在感染新世界猴的侵入阶段就被阻断，原因是病毒包膜蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4和CCR5之间不能有效的相互作用。虽然HIV能有效的侵入旧世界猴，但在侵入后阶段受到宿主细胞限制因子的制约，导致病毒不能有效复制。三种宿主限制因子解释了侵入后阻断：三维基体蛋白5α（TRIM5α）和脂蛋白APOBEC3家族以及膜蛋白BST2。在本论文中，我们通过对HIV-1的NL43病毒株骨架进行基因替换来解除HIV-1感染旧世界猴的限制因素。人源的TRIM5α，APOBEC3以及BST-2能够分别被HIV-1的CA， Vif以及Vpu所拮抗，但恒河猴的同源宿主限制因子不能被HIV-1的CA,Vif以及Vpu拮抗，而是能够被SIVmac239的CA, Vif以及HIV-1稀有亚型DH12的Vpu所拮抗。我们将HIV-1的CA，，Vif以及Vpu的穿膜区基因分别替换成SIVmac239的CA，Vif以及HIV-1DH12的Vpu穿膜区，获得了stHIV-1嵌合病毒质粒。我们在293T细胞中检测到嵌合病毒stHIV-1的结构蛋白的正常表达，并且能够成功包装出病毒颗粒。在此基础上，我们通过MAGI-CCR5细胞检测了包装出的病毒颗粒对人类细胞的感染能力，发现嵌合病毒能够成功感染人类MAGI细胞。替换部分的蛋白功能的验证结果表明：stHIV-1的Vif能够有效降解恒河猴的A3G蛋白，并且替换的Vpu能够拮抗Rh BST-2对病毒出毒的抑制。在检测stHIV-1的CA功能实验中，我们没能成功构建稳定表达恒河猴TRIM5α的人类T淋巴细胞系CEM×174，因此对于CA的功能验证需要在今后的stHIV-1感染恒河猴PBMC实验中进行间接验证。此外，我们还成功的检测到stHIV-1在CEM×174细胞系中的长期复制。在下一步计划中，我们需要完成在Rh PBMC细胞中检测stHIV-1的长期复制曲线，在此基础上对恒河猴进行病毒功毒以及病毒传代实验，我们希望改造的病毒能够在恒河猴体内稳定复制并且最终能导致恒河猴的致病。本论文的研究补充了BIV Vif-btA3Z2-Z3以及MVV Vif-oaA3Z2-Z3蛋白之间相互拮抗作用的机制，为病毒在牛羊中的疾病进程以及潜在的种属间感染提供可参考的意义。另外stHIV-1的构建有望成为更加理想的AIDS动物模型，推动AIDS治疗药物及疫苗的发展。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.91

【共引文献】