Transthyretin蛋白酪氨酸硝基化参与FAP患者淀粉样变形成的分子机制研究

发布时间：2018-03-10 19:29

本文选题：淀粉样变性　切入点：刚果红染色　出处：《天津医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的家族性淀粉样多发性神经损害(Familial amyloid polyneuropathy,FAP)是一种常染色体显性遗传性疾病,是由基因突变型转甲状腺素(Transthyretin,TTR)形成淀粉样变纤维沉积在细胞外所致。TTR主要由肝脏和脉络丛分泌,生理条件下以同源四聚体形式存在于血液以及脑脊液。研究报道FAP患者淀粉样沉积阳性组织内存在过氧化修饰产物,包括脂肪过氧化标记产物TEBRS、蛋白过氧化标记产物Carbonyl。此外TTR的S-亚硝基化能够引起其分子立体结构改变,在酸性条件下促进淀粉样变纤维形成。因此,氧化代谢修饰可能参与TTR淀粉样变纤维形成。本研究旨在研究FAP患者TTR蛋白酪氨酸硝基化修饰与淀粉样变纤维形成之间的关系,为解析FAP患者淀粉样变形成的分子机制奠定基础。方法1.选取FAP患者5例(男性3例,女性2例,年龄58-68岁),提取外周血细胞DNA,设计TTR基因4个外显子扩增引物,进行PCR体外扩增,之后将扩增产物进行DNA测序,分析FAP患者TTR基因突变类型。2.收集患者尸体解剖的心脏,肾脏以及脑组织,进行石蜡包埋,制备病理组织切片。将组织切片进行刚果红(Congo red,CR)染色结合偏振光显微镜观察,确定FAP患者组织中存在淀粉样变沉积。利用抗TTR特异性抗体免疫组织化学染色,鉴定淀粉样蛋白类型。3.对刚果红染色阳性的组织进行MPO免疫组织化学染色,检测淀粉样变沉积部位MPO表达。4.在FAP患者心肌组织切片上加入反应混合液(10m M PBS,pH7.4,含有100μM DTPA,100μM H2O2,10μM Na NO2和10μM N-acetyl-tyrosine),37℃下孵育12h,之后用抗3-硝基酪氨酸抗体进行免疫组织化学染色。5.对选取的FAP患者血清总蛋白进行定量TP在65.2-83.5g/L之间。每个研究对象分别取两份等量蛋白(200μg)血清,一份加入反应混合液(10m M PBS,p H7.4,含有100μM DTPA,150 m IU MPO,100μM H2O2,10μM Na NO2),另一份为对照组,37℃下孵育2h。6.将MPO/H2O2/NO2-反应体系作用于血清后进行双向电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)以及抗-TTR抗体免疫印迹(Western Blot)实验,对比该硝基化系统作用前后TTR的表达。结果1.利用PCR体外扩增技术以及结合DNA测序分析技术,分析FAP患者TTR基因型,确定FAP患者TTR基因突变型为TTR V30M。2.通过CR结合偏振光显微镜观察发现,FAP患者心脏,肾脏等组织中存在淀粉样变沉积,利用抗TTR免疫组织化学染色,确定淀粉样变蛋白类型为TTR蛋白。3.FAP患者心脏与脑组织的血管壁中存在淀粉样变沉积,其淀粉样变沉积成分主要累及血管的内膜和外膜。4.对FAP患者心脏、肾脏以及动脉血管组织进行抗MPO抗体免疫组织化学染色,其免疫反应阳性与淀粉样变沉积共存,提示患者组织内淀粉样变沉积成分中存在MPO成分。5.MPO/H2O2/NO2-反应系统与FAP患者淀粉样变沉积共同孵育,结果显示抗3-硝基酪氨酸抗体免疫反应与淀粉样沉积共存,提示淀粉样变蛋白成分能够发生硝基化。6.利用2-DE电泳以及抗3-硝基酪氨酸抗体Western Blot实验结果显示,在MPO/H2O2/NO2-系统作用下,FAP患者血清TTR的等电点发生改变以及表现出蛋白聚合。结论1.系统分析了FAP患者组织淀粉样变沉积分布特征,发现FAP患者血管淀粉样变沉积主要累积在血管壁内膜和外膜。填补了FAP淀粉样变沉积可累及的组织器官信息。2.首次报道FAP患者的淀粉样变沉积组织中存在MPO成分,且MPO/H2O2/NO2-反应体系能够介导FAP患者组织淀粉样变沉积处蛋白成分发生硝基化修饰。3.FAP患者血清TTR蛋白经过MPO/H2O2/NO2-体系作用,发生硝基化代谢修饰,并且TTR分子聚合具有明显增加趋势。总结研究结果提示FAP患者中TTR蛋白酪氨酸硝基化可能促进TTR聚合,进而有利于淀粉样变沉积形成。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R596

【参考文献】