8-OHdG和NADPH氧化酶p47phox G338A基因多态性与2型糖尿病肾脏病的相关性研究

发布时间：2018-03-15 22:34

  本文选题：NADPH氧化酶　切入点：基因多态性　出处：《河北医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:糖尿病肾脏病(Diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最常见的微血管并发症。DKD的发病机制与氧化应激、炎症反应、易感基因及肾血流动力学改变等多方面因素有关。Brown Lee[1]提出糖尿病及其并发症的统一机制学说,其核心是高糖引发的氧化应激(Oxidative stress,OS)。NADPH氧化酶是催化氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)生成的关键酶,广泛存在于肾血管内皮细胞、肾小球系膜细胞和足细胞,分子生物学研究发现,NADPH氧化酶亚基p47phox第338位上存在G→A突变,这与ROS产生增加及DKD发生、发展密切相关[2]。8-羟基脱氧鸟苷(8-Hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHd G)是DNA氧化损伤的特异指标,因其影响因素少,在体内含量稳定,被公认为评价机体氧化损伤程度的理想标志物[3]。本研究的目的是①通过酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者血清中8-OHd G含量,从而明确氧化应激在糖尿病及其肾脏疾病发生中所起的作用;②通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)联合单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)直接测序法探讨河北地区汉族人群NADPH氧化酶p47phox基因G338A多态性与DKD的发病及其病情程度关系,旨在对DKD的诊断及防治提供分子遗传学的理论依据。方法:依据1999年WHO糖尿病诊断和分型标准,选取本院内分泌科住院的T2DM患者198例,根据尿白蛋白与肌酐比值(尿A/Cr)将患者分为三组,A:单纯T2DM(Simple diabetes,SDM)组70例,其中男43例,女27例,年龄56.20±7.74岁,病程6.02±2.08年;B:微量白蛋白尿组65例,其中男41例,女24例,年龄58.09±9.42岁,病程9.73±4.59年;C:大量白蛋白尿组63例,其中男39例,女24例,年龄57.89±11.17岁,病程10.47±5.21年。正常对照(Normal control,NC)组为同期我院医务人员及常规体检者中健康个体70例,其中男42例,女28例,年龄55.60±10.81岁。入选者均为无亲缘关系河北地区汉族人。正常对照组和试验组性别与年龄匹配。本研究已通过伦理委员会审批,签署知情同意原则后,抽取受试者(禁食12h后)肘静脉血3ml,乙二胺乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝,用于提取基因组DNA;4ml静脉血,分离血清,用于检测各项生化指标和8-OHd G。(1)临床资料收集:包括性别、年龄、病程、身高(cm)、体重(kg)、血压(mm Hg)等,计算体质量指数(Body mass index,BMI)=体重/身高2;(2)血生化指标检查:使用全自动生化仪测定空腹血糖(Fasting plasma glucose,FBG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)及肝肾功能;(3)免疫比浊法测定糖化血红蛋白(Hb A1c)及尿微量白蛋白、肌酐比值(尿A/Cr);(4)酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清8-OHd G水平。(5)p47phox G338A基因多态性的测定:①基因组DNA提取:3ml的2%乙二胺乙酸(EDTA)抗凝血,用血液基因组DNA小量提取试剂盒提取外周血白细胞DNA,然后经紫光分光光度仪测DNA浓度及纯度。②聚合酶链反应(PCR)联合单核苷酸多态性(SNP)直接测序法检测p47phox G338A基因型:以外周血白细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增,用于扩增NADPH p47phox基因的引物序列根据基因文库的目的扩增区,经Primer Premier 5软件设计,然后由上海捷瑞生物工程有限公司合成,引物序列和扩增片段如下:名称引物序列扩增长度NADPHp47phoxF:5'-TCCCAAGTGGTTTGACGG-3 298bpR:5'-CCTCCTCTTTCTGGCTGTG-3 PCR总反应体系25ul,其中含12.5ul PCR Premix,8.5ul灭菌双蒸馏水,上下游引物各1ul,模板DNA 2ul。PCR反应条件:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸40 s,完成30次循环,末次循环后,在72℃充分延伸3 min,4℃冷却10 min。③进行PCR反应产物的纯化,PCR产物纯化试剂盒由上海捷瑞生物工程有限公司提供。④纯化后的PCR产物经SNP测序仪进行测序,测序结果在Genbank数据库中进行比较分析,证实P47phox基因第4外显子G338A多态性有GG、GA、AA三种基因型。(6)统计学处理:应用SPSS 16.0统计软件对结果进行统计学处理,对各组多态位点基因分布进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检测;计量资料进行正态性检验,统计描述以均值±标准差(X±s)表示;组间比较用方差分析;基因型频率和等位基因频率的比较用卡方检验;8-OHd G浓度与其他因素的相关性采用Spearman相关分析法;用多元逐步回归法分析各因素在T2DM肾脏病变发生中各自独立的作用及相对影响大小。结果:①正常对照组与T2DM组的年龄、性别构成比无差异(P0.05),具有可比性;与正常对照组比较,T2DM组的BMI、SBP、DBP、FBG、TC、TG及LDL-C均明显升高,HDL-C明显降低(P0.05或P0.01);与单纯T2DM组相比,DKD两组的病程、SBP、DBP、TC及TG均显著升高,HDL-C明显降低(P0.05或P0.01);与微量白蛋白尿组相比,大量白蛋白尿组病程、SBP、DBP明显升高,LDL-C则明显降低(P0.05),HDL-C则无明显差异(见Fig.1,Table 1)。②单纯T2DM组血清8-OHd G水平(5.02±0.69)较正常对照组(3.03±0.64)明显升高(P0.05);DKD两组血清8-OHd G水平均明显高于正常对照组和单纯T2DM组(P0.01),且大量白蛋白尿组(9.33±1.71)较微量白蛋白尿组(7.44±0.97)显著升高(P0.05)(见Fig.2)。③血清8-OHd G与病程(r=0.264,P=0.001)、SBP(r=0.195,P=0.004)、FBG(r=0.217,P=0.000)、Hb A1c(r=0.198,P=0.005)、TC(r=0.173,P=0.008)、TG(r=0.296,P=0.000)和LDL-C(r=0.187,P=0.007)呈显著正相关,与HDL-C呈显著负相关(r=-0.271,P=0.000)(见Table 2)。④正常对照组、单纯T2DM组、微量白蛋白尿组及大量白蛋白尿组GA+AA基因型频率分别为11.4%、18.6%、32.3%和38.1%,A等位基因频率分别为5.7%、10.0%、17.7%和21.4%。比较各组间的GA+AA基因型和A等位基因频率,单纯T2DM组与正常对照组间无显著性差异;DKD两组该频率均明显高于正常对照组和单纯T2DM组;而DKD两组间该频率无显著性差异(见Fig.6,Table 3)。⑤不同基因型组间年龄、性别、DBP、TC、TG、LDL-C、HDL-C均无显著性差异(P0.05);与GG型相比,GA+AA型的病程、Hb A1c、FBG、SBP及8-OHd G均明显升高(P0.05或P0.01)。GA+AA基因型组中DKD发病率为68.2%,显著高于GG基因型组的41.1%(X2为14.635,P0.01);GA+AA基因型与GG基因型相比,DKD发生率的危险度OR=3.072,OR值的95%可信区间为(1.705,5.537),即GA+AA基因型患DKD的风险约是GG基因型的3倍(见Fig.7、8,Table 4、5)。⑥多元逐步回归分析显示:病程(β=0.257,P=0.036)、LDL-C(β=0.357,P=0.015)、SBP(β=0.291,P=0.019)、FBG(β=0.285,P=0.022)和8-OHd G(β=0.473,P=0.008)是DKD的独立危险因素,而A等位基因并不是DKD的独立危险因素(见Table 6)。结论:1 T2DM患者体内8-OHd G水平升高,提示T2DM患者体内存在氧化应激。2河北地区汉族T2DM人群存在p47phox G338A基因多态性,A等位基因携带者血清8-OHd G水平较高。3 8-OHd G是DKD发生的独立危险因素,但A等位基因可能不是DKD的易感基因。
[Abstract]:Objective: diabetic kidney disease (Diabetic kidney, disease, DKD) is associated with the pathogenesis of oxidative stress,.DKD is the most common microvascular complications of diabetes inflammation, susceptibility gene and renal hemodynamic changes and other factors related to the.Brown Lee[1] of diabetes and its complications, unifying mechanism theory, its core is the oxidative stress caused by high glucose (Oxidative stress, OS).NADPH oxidase catalytic oxygen free radical (Reactive oxygen, species, ROS) key enzyme generated, widely exists in renal vascular endothelial cells, mesangial cells and podocytes, molecular biology research found that NADPH oxidase subunit p47phox 338th on G, A and ROS have increased the mutation. And DKD, [2].8- are closely related to the development of 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-Hydroxy-2-deoxyguanosine 8-OHd G) is a specific marker of oxidative damage to DNA, because of its less influence factors, in vivo The content and stability, is recognized as an ideal marker for [3]. evaluation of oxidative damage the body the purpose of this study is through enzyme-linked immunosorbent assay (Enzyme-linked immunosorbent, assay, ELISA) detection of type 2 diabetes (Type 2 diabetes mellitus 8-OHd G, T2DM) content in serum, so as to clear the oxidative stress in diabetes and disease the role of the kidney; by polymerase chain reaction (Polymerase chain reaction, PCR single nucleotide polymorphism (Single) combined with nucleotide polymorphism, SNP) to investigate the direct sequencing of Han population in Hebei area NADPH oxidase p47phox gene G338A polymorphism and the pathogenesis of DKD and its relation to severity of disease, diagnosis and prevention of DKD and provide a theoretical basis for molecular genetics. Methods: according to the 1999 WHO diabetes diagnosis and classification standard, a total of 198 T2DM patients in our hospital department of Endocrinology hospitalized cases, root 鎹�灏跨櫧铔嬬櫧涓庤倢閰愭瘮澹�

本文编号：1617162