NLRP3炎症小体在热应激损伤中的作用研究

发布时间：2018-03-16 23:32

本文选题：热应激　切入点：细胞损伤　出处：《第二军医大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分热应激损伤作用研究目的:通过体外、体内实验研究初步探讨热应激对细胞及组织的损伤作用。方法:1.体外研究。(1)热应激对细胞的损伤作用:分离C57BL/6小鼠原代腹腔巨噬细胞,接种于六孔板中培养。实验分为4个大组:37℃空白对照组、脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)复合38℃热应激组、LPS复合40℃热处理组和LPS复合42℃热应激组。每大组内设置三个热应激时间点(1 h、2 h、4 h)。空白对照组细胞置于37℃细胞培养箱中正常培养1 h、2 h、4 h;LPS复合热应激组细胞在加入LPS(100 ng/ml)预处理6 h后,分别置于38℃、40℃、42℃培养箱中培养1 h、2 h、4 h。处理结束后,显微镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞的存活率,试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的释放水平。(2)热应激后炎症细胞因子的释放:分离、培养C57BL/6小鼠原代腹腔巨噬细胞。实验分为空白对照组、LPS组、热应激组、LPS复合热应激组。其中,LPS复合热应激组细胞经LPS预处理6 h后,在38℃、40℃、42℃条件下分别孵育1 h、2 h、4 h。ELISA法检测细胞上清白细胞介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。2.体内研究。(1)C57BL/6小鼠分为正常对照组和LPS复合38℃、40℃和42℃热应激组,每组5只小鼠。LPS复合热应激组小鼠腹腔注射LPS(1 mg/kg),4 h后给予不同温度的热刺激。测定各组小鼠初始及热应激2 h后(或濒死时)的肛温,存活小鼠在热应激2 h后处死,取血测定血清IL-1β。(2)C57BL/6小鼠分为正常对照组和LPS组,检测LPS处理4 h后小鼠血象变化。(3)C57BL/6小鼠分为正常对照组、LPS组、热应激组和LPS复合40℃热应激组,每组10只小鼠。受热后每隔15 min监测四组小鼠肛温变化直至达到热射病标准42.7℃,记录生存时间绘制生存曲线。结果:1.体外研究。(1)热应激对细胞的损伤作用:LPS复合42℃,4 h热应激处理后,细胞形态发生明显变化,细胞萎缩,体积变小,细胞间隙变大,细胞膜轮廓模糊,细胞死亡过半。LPS复合40℃,4 h与LPS复合42℃,2 h热应激处理后细胞少量死亡。其他处理组细胞形态无明显变化。MTT测定结果显示,腹腔巨噬细胞经不同温度不同时间热应激后,LPS复合42℃,4 h热应激组细胞的存活率较其他组明显降低,其余各组之间细胞存活率没有明显差异。LDH测定结果显示,37℃正常孵育1 h、2 h、4 h,细胞上清中LDH含量均较低,细胞经LPS预处理后在38℃、40℃、42℃条件下孵育1 h、2 h和4 h,LDH释放量随着热应激温度与时间的增加有依赖性的升高,其中,LPS复合42℃,2 h热应激组和LPS复合42℃,4 h热应激组细胞LDH的释放量与空白对照组相比有显著差异。(2)热应激后炎症细胞因子的释放:与空白对照组相比,LPS组、LPS复合热应激各组细胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均显著升高。但与LPS组相比,LPS复合热应激组细胞上清中仅IL-1β的含量明显升高,提示LPS复合热应激仅进一步促进IL-1β的分泌。2.体内研究。(1)LPS复合热应激2 h(不足2 h的濒死即刻测量)后,40℃热应激组小鼠和42℃热应激组小鼠肛温均高于38℃组。血清ELISA结果显示LPS复合40℃热应激小鼠的血清IL-1β水平高于38℃和42℃热应激组小鼠。(2)LPS(1 mg/kg)处理4 h后,小鼠血液中白细胞量(White blood cell,WBC)和淋巴细胞比例(%LYMPH)较空白对照组相比显著降低,中性粒细胞比例(%NEUT)相比于空白对照组显著升高。(3)监测正常对照组、LPS组、热应激组和LPS复合40℃热应激组小鼠体温发现,空白对照组和LPS组小鼠实验期间前后肛温无明显变化,单纯热应激组小鼠肛温平缓升高。LPS复合热应激组小鼠受热15 min后肛温较单独热应激组迅速升高,且率先达到热射病标准温度42.7℃。生存分析结果显示,LPS组野生型小鼠在4 h的观察期内未见死亡。单纯热应激组野生型小鼠中位生存时间为2.72 h,平均生存时间为2.56h;LPS复合热应激组野生型小鼠的生存时间明显缩短,中位生存时间为1.47 h,平均生存时间为1.47 h。结论:LPS复合热应激对细胞有损伤作用,且损伤程度随着热应激温度的升高与时间的延长而加重。预先存在的LPS使机体对热的耐受力下降,小鼠易发生热射病,生存时间缩短。第二部分热应激增强LPS诱导的NLRP3炎症小体激活目的:明确热应激是否可以激活NLRP3炎症小体。方法:1.细胞实验。(1)根据第一部分研究结果,小鼠腹腔巨噬细胞在40℃,4h热应激后IL-1β分泌水平与空白对照组和LPS组均有显著性差异,且细胞损伤相对较轻。因此,确定热应激激活小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3炎症小体的最佳实验条件为热应激40℃,4 h。在此基础上,建立热应激下评价NLRP3炎症小体活性的细胞模型。实验分为四组:空白对照组、热应激组、LPS组、LPS复合热应激组。空白对照组细胞在37℃细胞培养箱中正常培养,LPS组细胞加入LPS(100 ng/ml)预处理6 h,更换培养基后在37℃细胞培养箱中继续培养,热应激组细胞在40℃细胞培养箱中培养,LPS复合热应激组细胞加入LPS(100 ng/ml)预处理6 h,更换培养基后在40℃细胞培养箱中继续培养。各组小鼠腹腔巨噬细胞给予相应处理后,收集细胞培养液上清,ELISA法测定炎症因子IL-1β的含量。提取各组细胞总蛋白,Western Blot法检测NLRP3炎症小体相关蛋白的表达变化,包括NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β。(2)提取各组细胞total RNA,Real-Time PCR检测NLRP3炎症小体相关组分基因NLRP3、ASC、Caspase-1的表达变化。2.动物实验。(1)C57BL/6小鼠按体重随机分为正常对照组、热应激组、LPS组、LPS复合热应激组,每组5只动物。热应激组小鼠放入40℃高温模拟仓(湿度60%±5%)中给予热应激,LPS组小鼠腹腔注射LPS,LPS复合热应激组小鼠腹腔注射LPS 4 h后与热应激组小鼠一同放入40℃高温模拟仓(湿度60%±5%)中给予热应激。以LPS复合热应激组小鼠全部死亡时间为终止时间,然后取血制备血清,ELISA法测定IL-1β的含量。(2)同时取上述各组实验动物的肝组织,提取各组肝组织总蛋白,Western Blot法检测NLRP3炎症小体相关蛋白的表达变化,包括NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β和p10。结果:1.细胞实验。(1)IL-1βELISA结果显示,空白对照组、LPS组、热应激组的细胞上清的IL-1β含量均较低,在基础水平,而LPS复合热应激组细胞上清的IL-1β含量较其它三组显著升高(P0.05)。Western Blot结果显示,与空白对照组相比,LPS复合热应激组NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β蛋白表达水平均升高。(2)PCR结果显示,LPS复合热应激组与其它三组相比,Nlrp3、Asc和Caspase-1基因表达水平显著升高(P0.05)。上述结果表明,经LPS预处理后,40℃孵育4 h可以激活小鼠原代腹腔巨噬细胞的NLRP3炎症小体。2.动物实验。(1)ELISA结果显示,与正常对照组、热应激组和LPS组相比,LPS复合热应激组小鼠血清的IL-1β分泌水平显著升高(P0.05)。(2)肝组织Western Blot结果显示,LPS复合热应激促进了小鼠肝组织中NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白的表达。(3)下丘脑组织Western Blot结果显示,LPS复合热应激促进了小鼠下丘脑中NLRP3、IL-1β和p10蛋白的表达。结论:实验结果表明,经LPS预处理后,热应激可以激活小鼠原代腹腔巨噬细胞的NLRP3炎症小体,促进巨噬细胞NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β蛋白的表达,以及IL-1β的分泌,Nlrp3、Asc和Caspase-1基因表达水平上调。小鼠经LPS处理后接受40℃热应激,血清IL-1β水平升高,肝组织中NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达上调,下丘脑中中NLRP3、IL-1β和p10蛋白表达上调。以上结果表明,LPS复合热应激在细胞水平和整体动物水平均可激活NLRP3炎症小体。第三部分NLRP3炎症小体在热应激损伤中的作用研究目的:探讨NLRP3炎症小体在热应激损伤中的作用。方法:利用与NLRP3炎症小体相关的三种基因敲除小鼠,即Nlrp3-/-小鼠、Caspase-1-/-小鼠和Asc-/-小鼠,分别建立热应激损伤的细胞模型和动物模型。1.细胞实验。培养野生型(C57BL/6)小鼠、Nlrp3-/-小鼠、Caspase-1-/-小鼠和Asc-/-小鼠的腹腔巨噬细胞,热应激条件:40℃,4 h,实验组别包括:空白对照组、热应激组、LPS组、LPS复合热应激组。处理结束后,收集各组细胞培养液上清,MTT法检测细胞的存活率,试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的释放水平,ELISA法测定IL-1β的含量。2.动物实验。(1)实验组别包括:空白对照组(野生型小鼠)、热应激组(野生型小鼠)、LPS组(野生型小鼠)、LPS复合热应激组(野生型小鼠)、LPS复合热应激组(Nlrp3-/-小鼠)、LPS复合热应激组(Caspase-1-/-小鼠)和LPS复合热应激组(Asc-/-小鼠)。热应激组小鼠放入40℃高温模拟仓中给予热应激,LPS组小鼠腹腔注射LPS,LPS复合热应激组小鼠腹腔注射LPS 4 h后放入高温模拟仓中给予热应激。然后做以下分析:1)热应激2 h采血制备血清(2 h内死亡动物濒死即刻采血),ELISA法测定血清IL-1β的含量。2)每隔15 min监测各组小鼠肛温变化。3)记录各组小鼠的生存时间,绘制动物生存曲线。(2)实验组别包括:热应激组、LPS复合热应激组、LPS复合热应激组+1μg IL-1β中和抗体(IL-1βNeutralizing antibody,IL-1βNA)、LPS复合热应激组+5μg IL-1βNA,实验动物均为野生型(C57BL/6)小鼠。小鼠腹腔注射LPS 4 h后尾静脉注射IL-1βNA,随后立即放入高温模拟仓中给予热应激。然后做以下分析:1)每隔15 min监测各组小鼠肛温变化。2)记录各组小鼠的生存时间,绘制动物生存曲线。结果:1.细胞实验:(1)各组细胞上清MTT结果显示,LPS复合热应激后,NLRP3炎症小体相关基因敲除组细胞存活率较野生型小鼠组升高。(2)各组细胞上清LDH结果显示,LPS复合热应激后,NLRP3炎症小体相关基因敲除组细胞的LDH释放水平较野生型小鼠组降低。(3)各组细胞上清ELISA结果显示,LPS复合热应激处理后,野生型小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β的量远远高于空白对照组、单纯热应激组及LPS组,而NLRP3炎症小体相关基因敲除组细胞经LPS复合热应激处理后,IL-1β处于基础水平,远低于野生型小鼠组。2.动物实验:(1)动物血清ELISA结果显示,野生型小鼠经LPS复合热应激后,血清IL-1β水平明显高于空白对照组、单纯热应激组及LPS组,而NLRP3炎症小体相关基因敲除小鼠经LPS复合热应激后,血清IL-1β水平比野生型小鼠明显降低,与LPS组相当。(2)三组基因敲除小鼠的肛温监测结果显示,Nlrp3-/-小鼠、Caspase-1-/-小鼠和Asc-/-小鼠经LPS复合热应激后肛温均低于野生型LPS复合热应激组小鼠。(3)生存分析结果显示,野生型LPS复合热应激小鼠中位生存时间为1.47 h,平均生存时间为1.52 h。Nlrp3-/-小鼠、Caspase-1-/-小鼠和Asc-/-小鼠经LPS复合热应激处理后,中位生存时间比野生型明显延长(P0.05 or P0.01),分别为2.76 h、2.97 h和2.18 h,平均生存时间分别为2.72 h、2.87 h和2.14h。(4)静脉注射5μg IL-1βNA后,小鼠肛温升高缓慢,低于未经IL-1βNA处理的LPS复合热应激组。(5)给予5μg IL-1βNA后,LPS复合热应激小鼠的生存时间明显延长。结论:细胞实验及动物实验结果显示,NLRP3炎症小体激活参与热应激损伤进程,抑制NLRP3炎症小体可延长LPS复合热应激后小鼠的生存时间,该作用与抑制NLRP3炎症小体激活产物IL-1β有关。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R594.1

【参考文献】