溴区包含蛋白7在糖尿病心肌病心肌细胞凋亡中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-20 18:13

本文选题：糖尿病性心肌病　切入点：溴区包含蛋白7　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景糖尿病性心肌病(DCM)是一种糖尿病引起的,与冠状动脉疾病、心脏瓣膜病和高血压无关的心脏疾病。DCM是导致糖尿病相关发病率和死亡率的主要原因。过去十年中对DCM的发病机制研究较多,主要包括受损的钙稳态、胰岛素抵抗、脂质摄取的增加、葡萄糖毒性、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS系统)激活和氧化应激。上述机制均可引起糖尿病患者广泛的心肌结构异常,如心肌间质纤维化、心肌细胞肥大和凋亡,并且最终导致左心室肥大和舒张和/或收缩功能障碍。其中,心肌细胞凋亡是糖尿病性心肌病发展过程中的主要事件。在STZ诱导的糖尿病大鼠中,早期即可观察到心肌细胞凋亡的显著增加。由于成人心肌细胞很少增殖,因此心肌细胞的丢失最终将导致心功能受损。因此,抑制心肌凋亡是预防DCM的重要策略。有研究报道内质网对细胞内环境的改变非常敏感,在DCM的发生发展过程中,内质网应激(ERS)介导的心肌细胞凋亡发挥重要的作用。然而,糖尿病诱导心肌细胞凋亡的分子机制仍不明确。溴区包含蛋白7(BRD7)是近年来发现的一种高度保守的蛋白。在人体组织中普遍表达,包括脑、心脏、肺、结肠和乳腺。它是溴区包含蛋白家族成员之一,并且作为重要的肿瘤抑制因子广泛参与细胞的各种生物学活动,如细胞生长与分化、细胞凋亡及细胞周期。近年来越来越多的研究报道BRD7在细胞凋亡始动环节的作用。最近一项研究表明,在肥胖小鼠的肝脏中BRD7通过调节XBP-1s核转位调控ERS信号通路。目前BRD7的研究多集中在肿瘤疾病中,对于DCM心肌组织中BRD7的表达及作用尚未见报道。本研究采用链脲佐菌素(STZ)诱导1型糖尿病大鼠模型为研究对象,探讨BRD7在DCM心肌组织中的表达及其对DCM的作用。研究目的1.研究BRD7在DCM心肌细胞中的表达情况;2.研究BRD7对DCM大鼠心室重构及心功能异常的影响;3.研究BRD7对糖尿病诱导的心肌间质纤维化及心肌细胞凋亡的影响。研究方法1.慢病毒shRNA-BRD7载体的构建设计3对针对大鼠BRD7基因的shRNA质粒,应用蛋白免疫印迹法分析每个质粒的干扰效率,选择其中效率最高的质粒,构建成含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的慢病毒载体。针对BRD7的干扰序列为5'-GGACTCTGGAGATGC-TGAA-3',空载体序列为5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。2.1型糖尿病大鼠模型的构建及shRNA-BRD7慢病毒体内转染将60只健康雄性Wistar大鼠(平均体重200±20g)适应性喂养1周后,随机分为四组(每组15只):正常对照组(NC组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病+慢病毒空载体组(DM+shRNA-N.C组)及糖尿病+BRD7基因沉默组(DM+shRNA-BRD7组)。三组糖尿病大鼠分别给与一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),剂量为60mg/kg。正常对照组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸盐缓冲液(PH4.5)。STZ注射后1周,取大鼠尾静脉血测量空腹血糖,连续2次空腹血糖≥ 16.7 mmol/L认为1型糖尿病造模成功。STZ注射后12周,DM+shRNA-BRD7组大鼠颈静脉注射1× 108 UT/50μl的shRNA-BRD7慢病毒载体,DM+shRNA-N.C组大鼠颈静脉注射同等剂量的慢病毒空载体。病毒转染4周后,对所有大鼠实施安乐死,留取血液及左室组织用于组织学及分子生物学检测。3.各组实验大鼠基本指标的测量血糖的检测:实验过程中,四组大鼠分别于STZ注射前(0周)、STZ注射后1周、12周、16周取尾静脉血检测空腹血糖水平。血压和心率的检测:于实验末期,检测各组大鼠的心率(HR)、尾动脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MBP)。每只动物测量3次后取平均值。4.超声心动图检测实验过程中,分别于STZ注射后12周、16周,采用M超及脉冲多普勒超声成像技术获取各组大鼠心功能参数,评价心功能。5.组织形态学检测各组大鼠心脏取材后,制备石蜡切片,进行常规HE染色以观察心脏组织形态及心肌细胞形态情况,Masson染色及天狼星红染色用以检测心肌胶原含量。采用免疫组织化学染色法,检测心肌组织内BRD7的表达及分布情况。6.TUNEL 染色采用TUNEL染色法检测各组动物左室心肌组织中心肌细胞的凋亡水平。7.Western blot 检测提取各组大鼠左室心肌组织蛋白,分别检测心肌组织内BRD7、CHOP、cleaved caspase-3、full length caspase-3、p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、t-AKT、Bax、Bcl-2和β-actin的蛋白表达水平。8.统计学分析所有数据均采用SPSS 17.0软件进行统计分析,并以均数±标准差(Mean±SD)表示,p0.05认为差异有统计学意义。研究结果1.实验动物的基本情况与正常大鼠相比,糖尿病组大鼠呈现多饮、多食、多尿及体态消瘦等症状。给予BRD7基因沉默治疗后,DM+shRNA-BRD7组大鼠一般状态较慢病毒空载体组稍微改善。2.各组实验动物的基本指标实验初期,各组大鼠血糖无明显差异,STZ注射后一周,三组糖尿病大鼠血糖水平明显高于正常对照组并维持到实验末期,抑制BRD7血糖水平较糖尿病组大鼠无明显改善。实验末期,各组大鼠血压无明显差异。DM组与正常对照组比较,体重(BW)明显降低,心率(HR)、心脏重量(HW)及心身比(HW/BW)升高;与糖尿病空载体对照组大鼠相比,抑制BRD7可降低HW和HW/BW,对体重及心率无明显影响。3.BRD7在DCM大鼠左室心肌组织中表达升高与正常对照组比较,糖尿病组大鼠心肌组织中的BRD7蛋白水平表达明显升高。ShRNA-BRD7慢病毒转染DM+shRNA-BRD7组大鼠心肌组织4周后,BRD7的蛋白表达较空载体对照组显著降低。4.抑制BRD7改善DCM大鼠的心功能异常糖尿病成模后12周,与正常对照组比较,三组糖尿病大鼠均呈现出左室舒张功能受损,主要表现为E/A降低;并伴有左室收缩功能障碍,表现为左室射血分数(LVEF)及左室短轴缩短率(FS)降低;同时左室舒张末内径(LVEDd)、左室质量(LVmass)及左室后壁厚度(LVPWd)均增加。实验末期与正常对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠E/A、LVEF、FS明显降低,LVEDd、LVPWd、LVmass显著增加。抑制BRD7可明显改善糖尿病引起的心功能障碍。5.抑制BRD7明显改善糖尿病诱导的心室重构和纤维化程度与正常大鼠相比,糖尿病大鼠心脏形态明显增大,心尖部变圆润,心腔扩大。镜下观察及分析,心肌细胞直径明显增宽,形态不规则,排列紊乱。抑制BRD7可显著改善心脏形态及结构的变化。Masson染色及天狼星红染色显示糖尿病组大鼠心肌间质纤维化程度明显高于正常组大鼠。与糖尿病及慢病毒空载体组相比,抑制BRD7可明显缓解心肌间质胶原沉积。6.抑制BRD7减少DCM大鼠的心肌细胞凋亡Western blot和TUNEL染色结果显示糖尿病大鼠心肌组织中cleaved caspase-3蛋白表达、Bax/Bcl-2的比值和心肌细胞凋亡数目显著增加;然而,与慢病毒空载体组相比,抑制BRD7明显降低糖尿病诱导的心肌细胞凋亡。CHOP是ERS通路的特异性凋亡因子。与正常大鼠比较,糖尿病大鼠心肌组织CHOP的蛋白表达明显升高,抑制BRD7可有效降低CHOP的表达。提示BRD7介导DCM心肌细胞凋亡与内质网应激通路有关。7.BRD7负向调控糖尿病大鼠心肌组织中AKT的活性Western blot检测结果显示,糖尿病组大鼠心肌组织中p-AKT(Ser473)和p-AKT(Thr308)的表达明显低于正常对照组,抑制BRD7后能够明显升高糖尿病大鼠心肌组织中AKT(Ser473)和AKT(Thr308)磷酸化水平。研究结论1.1型DCM大鼠心肌组织中BRD7蛋白水平表达明显升高;2.BRD7基因沉默明显改善糖尿病引起的心功能障碍、心室重构及心肌间质纤维化;3.BRD7基因沉默通过抑制内质网应激通路减少糖尿病诱导的心肌细胞凋亡。研究背景糖尿病(DM)是一种严重的、复杂的代谢性疾病,影响着全世界约4%的人口。糖尿病性心肌病(DCM)是在没有其他血管病理的情况下糖尿病引起的心肌特异性疾病。DCM的发病机制是一个缓慢且复杂的过程,其主要归因于自主神经异常、代谢紊乱、酶功能异常和间质性纤维化。此外,心肌细胞凋亡在糖尿病性心肌病的发生发展中起关键作用。溴区包含蛋白7(BRD7)是溴区包含蛋白家族的成员之一。BRD7作为肿瘤抑制因子,在细胞凋亡过程中发挥不可忽视的作用。有研究表明在肝癌细胞中,ERK信号通路的激活可诱导BRD7的蛋白表达。高糖刺激所介导的氧化应激及细胞因子均可激活ERK通路,使下游因子活性增强,参与DCM的发生发展过程。然而,在高糖条件下,ERK通路是否介导BRD7的表达尚未见相关报道。我们前期研究发现BRD7介导DCM的心肌细胞凋亡,其具体机制尚不明确。近期一项研究表明,在肥胖小鼠的肝细胞中,BRD7通过结合P85α促进XBP1核转位并增强XBP1的转录活性从而调控内质网应激(ERS)信号通路。内质网(ER)是细胞内重要的细胞器,负责脂质合成、钙稳态、蛋白质折叠和成熟。多种因素可以使ER功能紊乱从而导致未折叠/错误折叠蛋白的积累,如氧化应激、缺血和钙稳态异常,这个过程称为ERS。ERS早期作用为抑制蛋白质翻译和转运,促进分子伴侣表达,使ER功能恢复正常;然而,当刺激持续存在或过强时,ERS便启动细胞凋亡通路,最终导致细胞凋亡。慢性高血糖刺激诱导ERS信号通路的激活,包括糖调节蛋白78(GRP78)、X盒结合蛋白1(XBP-1)和C/EBP同源蛋白(CHOP)。我们通过STZ诱导的1型糖尿病大鼠模型证实ERS介导糖尿病引起的心肌细胞凋亡。在DCM病程中,XBP1诱导ERS特异性凋亡因子CHOP的表达促进心肌细胞凋亡。尽管ERS被证实参与DCM中心肌细胞凋亡过程,但其具体机制尚不明确。在DCM中,BRD7的促调亡作用是否与ERS信号通路相关仍有待研究。综上所述,本实验采用H9c2心肌细胞系为研究对象,高糖刺激H9c2心肌细胞系模拟糖尿病状态下高糖血症内环境,探讨高糖刺激诱导心肌细胞BRD7表达上调的机制及BRD7介导高糖诱导的心肌细胞凋亡的具体机制。研究目的1.探讨BRD7对高糖诱导的心肌细胞凋亡的影响;2.探讨高糖刺激诱导心肌细胞BRD7表达升高的机制;3.探讨高糖刺激下BRD7介导心肌细胞凋亡的信号转导机制。研究方法1.细胞培养本实验以H9c2心肌细胞系为实验对象,采用5.5mmol/L的正常糖浓度培养H9c2心肌细胞作为正常对照组(NG)。以33.3mmol/L的葡萄糖作为高糖(HG)刺激,分别以HG刺激心肌细胞6h,12h,24h,48h。5.5mmol/L葡萄糖+27.5mmol/L甘露醇作为高渗对照组(OC),分别刺激心肌细胞6h,12h,24h,48h。2.细胞干预采用慢病毒转染shRNA-BRD7的技术抑制心肌细胞BRD7的基因表达,慢病毒转染shRNA-N.C作为阴性对照组;采用特异性抑制剂U0126抑制ERK通路的活性,DMSO作为阴性对照组。3.TUNEL染色法检测细胞凋亡采用TUNEL染色法检测不同条件下心肌细胞的凋亡水平。4.Western blot 检测收集各组细胞,提取总蛋白及核蛋白,分别检测BRD7、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、full length caspase-3、CHOP、XBP-1s、p-ERK、t-ERK、p-AKT和t-AKT的蛋白表达水平。5.激光共聚焦显微镜采用细胞免疫荧光技术检测心肌细胞中BRD7的分布情况,同时检测不同刺激下心肌细胞中XBP-1s的核转位情况。5.统计学分析应用SPSS 17.0软件统计分析数据,以均数±标准差(Mean±SD)表示,p0.05认为差异有统计学意义。研究结果1.高糖刺激时间依赖性诱导H9c2心肌细胞系的凋亡及BRD7的表达采用高糖分别刺激H9c2心肌细胞6h,12h,24h,48h。Western blot结果显示,与NG组相比,高糖刺激24h和48h后Bax/Bcl-2的比值及cleaved caspase-3的蛋白表达水平显著升高。OC组心肌细胞凋亡水平与NG组无显著差异。与对照组比较,高糖刺激心肌细胞24h后BRD7蛋白表达开始升高,并且于48h达到顶峰。高渗刺激对BRD7的表达没有明显影响。2.抑制BRD7可显著减少高糖诱导的心肌细胞凋亡慢病毒转染shRNA-BRD7技术可明显抑制心肌细胞BRD7的蛋白表达。Western blot及TUNEL染色结果显示,与慢病毒空载体组相比,抑制BRD7显著降低Bax/Bcl-2的比值、cleaved caspase-3蛋白表达及心肌细胞凋亡率。3.高糖刺激通过激活ERK通路诱导心肌细胞BRD7的表达及细胞凋亡与NG组相比,高糖刺激诱导ERK1/2的磷酸化;与高糖阴性对照组相比,特异性抑制剂U0126显著降低ERK1/2的活性,同时BRD7蛋白表达明显减少。细胞免疫荧光检测发现,高糖刺激能够升高细胞核中BRD7的表达,抑制ERK通路后,细胞核中BRD7的表达明显减少。我们进一步研究了 ERK通路对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响。与正常组相比,高糖刺激降低生存信号AKT的磷酸化,抑制ERK1/2的活性明显升高p-AKT的表达;同时,与对照组相比,抑制ERK1/2磷酸化显著降低Bax/Bcl-2比值及cleaved caspase-3 蛋白表达。4.BRD7通过调控ERS通路介导高糖诱导的心肌细胞凋亡4.1.高糖刺激下BRD7调控XBP-1s的核转位Western blot结果显示,与对照组比较,高糖刺激诱导XBP-1s核转位及总蛋白的表达;与慢病毒空载体组相比,BRD7基因沉默明显抑制XBP-1s核转位,但对其总蛋白表达无显著影响。细胞免疫荧光技术验证不同条件下心肌细胞中BRD7和XBP-1s的定位。结果发现,正常条件下,BRD7位于细胞核中,XBP1主要位于胞质内;高糖刺激诱导XBP-1s向核内转移并与BRD7共表达;BRD7基因沉默后明显抑制XBP-1s的核转位。4.2.抑制BRD7明显减少高糖诱导的CHOP蛋白表达采用western blot检测BRD7对XBP-1s下游凋亡因子CHOP表达的影响。结果显示,与正常组相比,高糖刺激心肌细胞24h和48h后CHOP蛋白表达显著升高,高渗刺激对CHOP表达无显著影响。同时,与空载体组相比,抑制BRD7可明显降低高糖诱导的CHOP表达。研究结论1.高糖刺激通过激活ERK通路诱导心肌细胞BRD7的表达;2.抑制BRD7明显减少高糖介导的心肌细胞凋亡;3.BRD7基因沉默通过抑制XBP-1s/CHOP信号通路降低高糖诱导的心肌细胞凋亡。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R542.2

【参考文献】