红斑狼疮患者Bruton酪氨酸激酶变化的临床意义及间充质干细胞对其表达的调节

发布时间：2018-03-27 23:17

  本文选题：红斑狼疮　切入点：系统性　出处：《南京医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：背景:系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种可累及多种器官的自身免疫病,常伴有肾脏损害,皮肤炎症,血细胞减少等症状。研究表明B细胞参与了SLE的发病,而B细胞的活化、增殖和分化主要受B细胞抗原受体(B cell antigen receptor,BCR)信号通路调控。其中Bruton酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,Btk)是BCR信号通路的下游分子之一,是一种非受体酪氨酸激酶。文献报道当C57BL/6小鼠的CD19+细胞过表达Btk时,会出现抗核抗体(Anti-nuclear antibody,ANA)以及狼疮样症状。脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cell,UC-MSC)是一种多潜能的干细胞,在特定条件下可分化成多种细胞,同时它还具有免疫抑制和修复功能,所以目前已被用于治疗多种自身免疫性疾病。目的:本研究旨在探索Btk在SLE中的异常表达,分析其与SLE的相关性,并进一步探讨UC-MSC对SLE患者B细胞中Btk的调节作用。方法:采用Ficoll法分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),流式细胞术检测Btkhigh B细胞的百分率。酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测患者血清抗双链DNA(Double-strands DNA,dsDNA)抗体含量。结合SLE患者临床检查资料,分析Btkhigh B细胞百分率与SLE患者的病情活动评分(SLE disease activity index,SLEDAI)、血清补体C3、C4水平、血清抗dsDNA抗体含量、血沉(Erythrocyte sedientation rate,ESR)、24小时尿蛋白(Urine protein)的相关性。免疫磁珠分选SLE患者和健康对照外周血B细胞以及MRL/lpr小鼠和C57BL/6小鼠脾脏B细胞。免疫印迹法(Western blot,WB)检测B细胞的Btk表达。免疫组化检测狼疮性肾炎患者以及肾癌患者癌旁组织的肾小球中Btk的表达,用平均光密度值(mean optical density,MOD)表示。PBMCs经CpG2395(2.5μg/ml),anti-CD40(3μg/ml),F(ab’)2 anti-human IgM(2μg/ml),IL-4(50ng/ml)共同刺激后,分别在与UC-MSC直接接触共培养(10:1)、160μmol/L环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)、1μmol/地塞米松(Dexamethasone,DEX)及1μmol/L RN486(Btk抑制剂)条件下培养72小时后,流式细胞术检测Btkhigh B细胞的比例。结果:SLE患者外周血Btkhigh细胞百分率较正常人显著升高(1.74%±0.15%vs0.86%±0.06%,p0.001),Btkhigh B细胞的百分率较正常对照组显著升高(3.89%±0.31%vs 2.61%±0.21%,p0.01),并且与SLEDAI(r=0.53,p0.01)、血清抗dsDNA抗体水平(r=0.41,p0.05)以及24小时尿蛋白量(r=0.59,p0.05)呈正相关,与血清补体C3水平(r=-0.41,p0.05)呈负相关,但与血清补体C4水平和ESR无相关性。免疫印迹法显示SLE患者外周血B细胞中的Btk与正常对照相比有升高的趋势,但无统计学意义,而MRL/Lpr狼疮鼠脾脏B细胞Btk的表达较C57BL/6小鼠显著升高。我们分析SLE患者的临床症状发现狼疮性肾炎患者的外周血Btkhigh B细胞的百分率较无狼疮性肾炎的SLE患者显著升高(4.71%±0.481%vs 3.19%±0.30%,p0.05)。免疫组化结果显示狼疮性肾炎(Lupus nephritis,LN)患者肾小球中Btk的表达显著高于肾癌患者癌旁组织肾小球Btk的表达(0.03±0.003 vs 0.01±0.002,p0.001)。用CpG2395,anti-CD40,F(ab’)2anti-human IgM和IL-4共同刺激正常人外周血PBMCs72小时后,Btkhigh B细胞百分率显著高于对照组(40.63%±10.84%vs 3.17%±0.25%,p0.05),且Btk在B细胞中的平均荧光强度(Mean fluorescent intensity,MFI)在刺激后也显著升高(12.53±0.30 vs 9.58±0.79,p0.05)。将SLE患者外周血PBMCs与UC-MSC以1:10的比例共培养三天后,其Btkhigh B细胞的百分率较对照组明显减少(29.00%±1.34%vs 50.03%±4.69%,p0.05)。同样,UC-MSC也可以显著抑制正常人外周血Btkhigh B细胞(16.90%±1.65%vs 39.48%±1.14%,p0.001)。而目前临床上用于治疗SLE的DEX和CTX均不能抑制Btkhigh B细胞百分率。结论:狼疮性肾炎患者中Btk的表达显著升高,且Btkhigh B细胞的百分率与SLE患者的病情活动有关,提示Btk可能成为治疗SLE的新靶点。UC-MSC可以抑制B细胞中Btk的表达发挥免疫调节作用,可能为其治疗SLE的机制之一。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.241

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本文编号：1673700