间充质干细胞通过调控sHLA-G上调Treg治疗SLE的作用及机制研究

发布时间：2018-03-30 04:00

本文选题：间充质干细胞　切入点：人类白细胞抗原G　出处：《南京大学》2017年博士论文

【摘要】：背景:系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种累及多系统的自身免疫性疾病,主要表现为淋巴细胞过度活化、自身抗体产生、免疫复合物沉积、炎性细胞因子增多等。近年来研究显示,狼疮患者体内Treg细胞数目和功能都存在异常,在狼疮的发病中扮演重要角色。人类白细胞抗原G(Human leukocyte antigen-G,HLA-G)具有较强的免疫抑制功能,可以抑制T细胞增殖和上调Treg细胞,包括膜结合型HLA-G(mHLA-G)及可溶性HLA-G(sHLA-G)两种分子表达形式。sHLA-G是间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)分泌的一个关键的调控因子。MSCs具有强大的免疫调节功能,治疗难治性SLE患者取得了较好的疗效,但机制尚不清楚。目的:检测SLE血清sHLA-G的变化,分析sHLA-G水平和SLE病情活动指标的相关性;探讨MSCs移植治疗狼疮鼠和SLE患者的疗效及机制;阐明MSCs通过sHLA-G上调Treg细胞治疗SLE的机制。方法:1)酶联免疫吸附法(ELISA)检测68例SLE患者与32例健康对照者血清中sHLA-G的水平,分析SLE患者sHLA-G水平与SLEDAI评分、病程时间、血小板、肝功能、肾功能、血清补体C3、C4、血清抗dsDNA抗体、血沉、C反应蛋白、24小时尿蛋白等相关性;采用密度梯度离心法(Ficoll法)分离15例SLE患者和15例健康对照者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),流式细胞术检测 CD4+ILT2+、CD8+ILT2+、CD19+ILT2+和 Treg细胞百分率。2)用小分子干扰 RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)干扰 MSC 表达的 sHLA-G,然后将24周龄雌性B6.MRL-Faslsr小鼠随机分为MSCs治疗组、HLA-G siRNA MSCs治疗组和PBS组,并设同样周龄的雌性C57BL/6小鼠为对照组,分别从尾静脉注射1×106个细胞或等体积PBS。6周后处理小鼠。检测小鼠脾脏指数、24小时尿蛋白、淋巴细胞亚群,分析肾脏病理。10例难治性SLE患者进行人脐带 MSCs(Umbilical Cord-derived MSCs,UC-MSCs)移植,按 106 个/kg 体重输注细胞。移植前及移植后24小时分别抽取全血,分离血清,ELISA检测移植前后sHLA-G和TGF-β1变化,流式检测Treg细胞和其表面PD-1、CTLA-4分子水平以及CD4+ILT2+、CD8+ILT2+细胞和CD19+ILT2+细胞百分率。3)分离SLE患者及健康对照组骨髓间充质干细胞(Bonemarrow-derived MSCs,BM-MSCs),ELISA及PCR检测SLE患者及健康对照者BM-MSCs的sHLA-G表达。将SLE患者PBMC与UC-MSCs不同比例下共培养3天,加或不加HLA-G中和抗体,流式检测CD4+CD25+Foxp3+ T细胞百分率和T淋巴细胞增殖变化。磁珠分选CD4+ T和CD4+CD25-T细胞,与MSCs共培养3天。IFNy刺激MSCs 48小时后PCR检测HLA-G mRNA表达。诱导SLE患者巨噬细胞,与MSCs共培养48小时,PCR检测HLA-G mRNA表达。结果:狼疮性肾炎患者血清sHLA-G水平(19.6±10.9ng/ml)较无肾脏累及的SLE患者(25.3±8.8ng/ml)显著降低;活动性狼疮患者(SLEDAI4)的血清sHLA-G水平与SLEDAI评分呈负相关;此外,SLE患者血清sHLA-G水平与疾病病程、血肌酐、尿素氮、尿酸和24小时尿蛋白呈负相关,与血小板呈正相关。SLE患者CD4+ T细胞和CD19+ B细胞上sHLA-G受体ILT2表达及Treg细胞百分率显著下降,且CD4+ILT2+T细胞百分率与Treg细胞百分率成正相关。在小鼠中,MSCs治疗组脾脏指数、24小时尿蛋白、肾脏病理显著改善,但HLA-G siRNA MSCs治疗组与MSCs治疗组疗效基本相当。两个细胞治疗组均可显著上调Treg细胞、Breg细胞和巨噬细胞百分率,下调Th17、Tfh细胞百分率,HLA-GsiRNA MSCs治疗组下调浆细胞能力稍弱。SLE患者MSCs移植治疗后血清sHLA-G水平显著升高,Treg水平及其表面PD-1、CTLA-4水平显著升高,CD4+ILT2+细胞百分率也显著升高。SLE患者BM-MSCs表达sHLA-G水平较健康对照组表达水平下降。MSCs体外可以浓度依赖性的上调Treg细胞百分率,加入HLA-G中和抗体后Treg细胞百分率显著降低。MSCs可以部分通过sHLA-G抑制CD4+T淋巴细胞增殖。MSCs可以上调CD4+T细胞中的Treg细胞百分率,但不能诱导CD4+CD25-T细胞转化为Treg细胞。IFNy可以上调MSCs表达的HLA-G mRNA水平。MSCs不能上调巨噬细胞表达的HLA-G mRNA水平。结论:SLE患者体内sHLA-G及其受体ILT2表达异常,可能参与了系统性红斑狼疮的发病。MSCs移植治疗SLE患者可上调sHLA-G和Treg细胞,提示MSCs可能通过调控sHLA-G上调Treg细胞治疗狼疮患者,但在小鼠中可能不通过调控sHLA-G发挥作用。
[Abstract]:BACKGROUND : Systemic lupus erythematosus ( SLE ) is a kind of autoimmune disease involving multiple systemic lupus erythematosus ( SLE ) . The levels of serum sHLA - G and TGF - 尾1 were detected by ELISA and PCR . The levels of serum sHLA - G and CD4 + CD25 - T cells were detected by ELISA and PCR . The levels of serum sHLA - G and CD4 + CD25 - T cells were detected by ELISA and PCR . Results : The serum sHLA - G levels of SLE patients were negatively correlated with the SLEDAI score . The expression of sHLA - G receptor ILT2 and the percentage of CD4 + ILT2 + cells in SLE patients were significantly higher than those in healthy controls .

【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R593.241

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