APS联合HUCMSCs对糖尿病大鼠肾脏病变的改善作用及其机制研究
本文选题：黄芪多糖 切入点：人脐带间充质干细胞 出处：《吉林大学》2017年硕士论文
【摘要】：糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最为严重的慢性微血管并发症之一,严重者易引发终末期肾衰竭(end stage renal disease,ESRD),其发病机制主要有糖脂代谢紊乱、细胞外基质积聚、氧化应激损伤、血流动力学异常、细胞因子及偶联信号通路中关键蛋白表达异常等。micro RNA是一种由19~25个核苷酸构成的内源性非编码单链RNA,能够在m RNA的翻译过程中负向调控靶基因的表达。micro RNA的发现为进一步探讨糖尿病肾病的发病机制提供了新的契机。NOX4(NADPH oxidase 4,NOX4)是NADPH氧化酶在肾脏中的主要活性亚基,它的异常激活能够引发氧化应激损伤,另外,NOX4/PKC/Rho A/ROCK形成了相互循环的作用机制,共同调节糖尿病肾病的发病过程。黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)具有降糖、改善胰岛素抵抗、提高胰岛素敏感性、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、提高免疫力等活性,人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,HUCMSCs)具有横向分化、旁分泌和免疫调节的作用,二者在糖尿病的治疗中均取得了较大的研究进展,但APS联合HUCMSCs共同干预治疗糖尿病大鼠肾损伤的研究尚未见有国内外文献报道。目的:本研究以APS联合HUCMSCs共同干预治疗糖尿病大鼠,观察并检测其对糖尿病大鼠糖脂代谢、肾功能、氧化应激及肾脏病理形态学的改善作用,并从micro RNA角度探讨其作用机制。方法:Wistar大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制备糖尿病模型,随机分为DN组,APS组(APS 12.5g/kg,1次/d),MSCs组(HUCMSCs 2×106个/只,1次/2 w),A+M组(APS 12.5g/kg,1次/d;HUCMSCs 2×106个/只,1次/2 w),Gli组(格列本脲1.5mg/kg,1次/d),Bena组(贝那普利12mg/kg,1次/d),另设Con组为正常对照组,连续给药12 w。通过对各组大鼠的糖脂代谢、肾功能、抗氧化能力及肾脏病理形态学检测(HE染色、PAS染色和免疫组织化学染色),探讨APS联合HUCMSCs对糖尿病大鼠肾脏病变的改善作用。另外,采用micro RNA芯片技术获得Con、DN及A+M组大鼠肾组织micro RNA差异表达谱,筛选各组间特异性表达的micro RNAs,并以real-time PCR检测其相对表达量。以生物信息学软件预测micro RNA靶基因并行功能分析,并通过免疫组织化学法及western blot实验检测其靶蛋白及偶联信号通路中关键蛋白的相对表达量,进一步研究APS联合HUCMSCs改善糖尿病大鼠肾脏病变可能的作用机制。结果:1、DN组大鼠表现出明显的“三多一少”症状,血糖值明显高于正常水平,尿BUN、UAER、UAlb及血清BUN水平明显升高,CCR水平明显降低,血脂T-CHO、TG、LDL-C水平明显升高,HDL-C含量明显降低(P0.01),表明DN组大鼠的糖脂代谢及肾功能出现紊乱。治疗组以上各指标均呈现不同程度的改善,其中A+M组大鼠的血糖、UAER、UAlb、血清BUN、CCR及T-CHO、TG、LDL-C较其他治疗组改善最为明显,提示APS联合HUCMSCs能显著改善糖尿病大鼠的糖脂代谢及肾功能,并优于单独给予APS和HUCMSCs治疗组。2、DN组大鼠的血清及肾组织匀浆中T-SOD、T-AOC、CAT及GSH-PX水平较Con组显著降低,MDA含量显著升高(P0.01),表明DN组大鼠出现氧化应激损伤。治疗组大鼠以上氧化应激指标呈现不同程度的改善,其中A+M组大鼠血清及肾组织匀浆中以上指标改善最为明显,优于单独给予APS和HUCMSCs治疗组。3、DN组大鼠肾脏组织切片呈现出明显的病理改变,肾小球体积增大,毛细血管基底膜增厚,系膜细胞增生,糖原阳性染色区域增多,细胞外基质积聚,FN和Col IV表达量升高。各治疗组中A+M组肾脏形态学改善最为显著,优于单独给予APS和HUCMSCs治疗组,肾小球未见明显肥大,系膜细胞未见明显增生,基底膜未见明显增厚,糖原表达降低,细胞外基质的主要成分FN、Col IV的表达量无明显增多。4、micro RNA芯片结果显示,与Con组相比,DN组大鼠肾组织中分别有15/6个micro RNAs表达上调/下调;与DN组相比,A+M组大鼠的肾组织中分别有21/19个micro RNAs表达上调/下调。real-time PCR结果表明rno-mi R-208a-3p、rno-mi R-363-5p在DN组中表达明显高于Con组,与DN组相比A+M治疗组表达显著降低(P0.01)。靶基因预测发现与rno-mi R-208a-3p相关的基因有146个,与rno-mi R-363-5p相关的基因有678个。5、发现NOX4作为rno-mi R-363-5p的靶基因之一,介导了NOX4/PKC/Rho A/ROCK信号通路。免疫组织化学及western blot结果显示NOX4、PKCβ、Rho A、ROCK1在DN组肾脏中表达量显著升高,在A+M组中表达明显低于DN组。根据研究结果得出以下结论:1.APS联合HUCMSCs能够显著改善糖尿病大鼠的糖脂代谢、肾功能、氧化应激水平及肾脏病理改变,且效果优于单独给予APS和HUCMSCs。2.APS联合HUCMSCs能够调节糖尿病大鼠肾脏rno-mi R-208a-3p及rno-mi R-363-5p的表达。3.APS联合HUCMSCs能够抑制肾组织中NOX4活性,调节NOX4/PKC/Rho A/ROCK信号通路,且其作用优于单独给予APS和HUCMSCs。4.APS联合HUCMSCs对糖尿病大鼠肾脏病变的改善作用可能是通过或部分通过调节肾脏中rno-mi R-363-5p的表达,抑制NOX4活性进而抑制NOX4/PKC/Rho A/ROCK信号通路的激活实现的。创新点:本研究首次观察了APS联合HUCMSCs对糖尿病大鼠肾脏病变的改善作用,并从micro RNA角度探讨了其作用机制,发现APS联合HUCMSCs能下调糖尿病大鼠肾组织中rno-mi R-363-5p的表达,抑制靶基因NOX4活性,抑制肾小球细胞中PKCβ表达,阻碍Rho A/ROCK信号通路的激活,改善糖尿病肾脏病变。
[Abstract]:Diabetic nephropathy ( DN ) is one of the most serious complications of diabetic nephropathy in diabetic nephropathy . Methods : To investigate the effect of APS combined with HUCMSCs on diabetic nephropathy in diabetic rats . Compared with Con group , the levels of T - SOD , T - AOC , CAT and GSH - PX in diabetic rats were significantly lower than that in Con group . The expression of rno - mi R - 363 - 5p in diabetic rats was detected by APS combined with HUCMSCs . The results showed that APS combined with HUCMSCs could significantly improve the expression of rno - mi R - 363 - 5p in diabetic rats .
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R692.9
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，本文编号：1699044
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