GLP-1融合蛋白与Betatrophin的表达及生物活性研究

发布时间：2018-04-04 23:10

  本文选题：胰高血糖素样肽-1　切入点：结构修饰　出处：《中国农业科学院》2017年博士论文

【摘要】：糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病,由胰岛素相对缺乏导致糖类代谢功能紊乱引起,如何解决治疗达标和低血糖症之间的矛盾以及如何阻止胰岛β细胞的功能进行性减退是当前治疗糖尿病面临的2大挑战。肠源性激素胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)因其依赖葡萄糖浓度促进胰岛β细胞分泌胰岛素来降低血糖水平,不会造成严重低血糖而引起广泛关注。然而,人体自身产生的GLP-1极易被体内的二肽基肽酶4(DPP-IV)降解,其血浆半衰期不足2分钟,这就大大限制了天然GLP-1分子的临床应用,并且GLP-1受体激动剂的应用还未实现口服给药。此外,人体肝脏和脂肪组织分泌的促胰岛生长素(Betatrophin)是近年来才发现的一种动物激素,已证实它参与机体的脂肪代谢过程,但在能否促进胰岛β细胞增殖方面还存在很大分歧。老年β细胞功能丧失是产生糖尿病的主要原因,Betatrophin能否对更大年龄的糖尿病小鼠起作用还有待证明。因此,本文通过对GLP-1进行结构修饰、mGLP-1的化学合成与生物活性检测、6×mGLP-1的融合表达与功能研究、Betatrophin的重组表达与功能研究,以期为后续开发治愈糖尿病新疗法打下基础,现已取得如下进展:1、mGLP-1是通过分别对天然GLP-1分子内DPP-IV与胰蛋白酶(Trypsin)敏感位点的氨基酸残基进行替换(His~7-Ala~8突变为His~7-Gly~8,Lys~(26,34)突变为Gln~(26),Asp~(34))以及后续化学合成而获得,和天然GLP-1相比,mGLP-1在体外可有效抵抗Trypsin、胰酶(Pancreatin)的降解,并且依然具有刺激胰岛β细胞增殖、促进胰岛素分泌、改善小鼠对葡萄糖的耐受性并降低2型糖尿病小鼠(经STZ化学方法诱导而成)血糖水平的活性,并且这种活性更为强效,且不会引起严重的低血糖症。然而,要想在口服给药途径上取得活性还有待进一步研究;2、6×mGLP-1是在已有研究的基础上,通过分别对天然GLP-1分子内DPP-IV与Trypsin敏感位点的氨基酸残基进行替换(His~7-Ala~8突变为His~7-Ser~8/Gly~8,Lys~(26,34)突变为Gln~(26),Asn~(34)/Asp~(34))、C末端添加Cys、首尾相连形成6个串联重复、C末端添加His-tag、密码子优化、原核表达与纯化等途径获得,并且经HPLC检测其纯度完全符合实验要求。研究发现,在体外,6×mGLP-1可以形成二聚体、三聚体,可被Trypsin降解成具有Trypsin抗性的单体,并且不管是6×mGLP-1作为一个整体还是被Trypsin水解成的单体,均能刺激胰岛β细胞增殖;在体内,6×mGLP-1经腹腔注射或灌胃口服均能改善小鼠对葡萄糖的耐受性,腹腔注射可以有效降低2型糖尿病小鼠的血糖水平,作用时间可长达16.7个小时,并且不会引起低血糖症;口服灌胃给db/db小鼠也可产生近4个小时的降血糖效果。血清动力学结果显示,6×mGLP-1能够以完整的六联体形式在小鼠体内稳定存在长达24小时之久;3、mGLP-1和6×mGLP-1作为天然GLP-1结构类似物/GLP-1受体激动剂,半衰期均得到有效延长,在降糖活性方面也更强效,对6×mGLP-1药代动力学的完善以及口服给药方式的攻克将会使其超越目前市售的所有以皮下注射给药的GLP-1受体激动剂;4、成熟形式的Betatrophin重组蛋白经密码子优化、原核表达与纯化等途径获得并且经SDS-PAGE检测其纯度完全符合实验要求。本研究发现,在体外,r-Betatrophin不能刺激胰岛β细胞增殖,却可以通过上调Egr1基因的表达量、下调ATGL基因的表达水平来刺激HepG2细胞分泌甘油三酯;在体内,r-Betatrophin经腹腔注射可以提高成年和老年KM小鼠血浆的甘油三酯含量,可改善中年和老年KM小鼠对葡萄糖的耐受性,却对db/db小鼠的糖耐量没有影响。因此,实验结果初步表明,r-Betatrophin具有调控糖类和脂质代谢的双重作用。Betatrophin对糖脂代谢的影响越来越受到广泛认可,但对糖类代谢影响的研究也才刚起步不久,相信随着对Betatrophin影响脂类代谢分子机制的完善以及糖类代谢研究空白的填补,人们对代谢综合征的治疗将会迈出更大一步。本实验利用基因工程技术获得大量具有生物活性的6×mGLP-1融合蛋白以及人Betatrophin重组蛋白。6×mGLP-1融合蛋白体内半衰期的有效延长以及口服给药方式的可行性为研发2型糖尿病新药奠定一定的理论和物质基础。Betatrophin重组蛋白通过增强胰岛素的活性来改善中老年小鼠对葡萄糖的耐受性,为其参与糖类代谢提供了新的实验证据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.1

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本文编号：1712111