靶向多亚型IFNα的新表位全人源单抗的体外亲和力成熟

发布时间：2018-04-09 00:09

本文选题：干扰素α　切入点：中和抗体　出处：《安徽大学》2015年硕士论文

【摘要】：AIA22是从大容量全合成人单链噬菌体抗体库中通过高通量固相筛方法获得的一个抗多亚型IFNα全人源抗体分子,具有有别于临床在研同靶点抗体(Sifalimumab和AGS-009)的全新抗原表位(IFNAR2结合表位),能够有效中和除IFNa-7以外的全部IFNα亚型,具备与临床在研同靶点抗体完全不同的IFNα亚型中和谱。前期研究证实,AIA22较对照抗体Sifalimumab具有明显的表位优势,主要体现为AIA22在对IFNα-2b等亚型亲和力低于Sifalimumab的情况下表现出明显优于Sifalimumab的中和活性。但是,AIA22对多数亚型IFNα(IFNa-2b、4b除外)的中和活性不及对照抗体Sifalimumab,提示候选抗体分子AIA22有待进一步改造,以提升其对多个亚型IFNα的中和活性。本研究主要依赖基于结构的抗体体外亲和力成熟技术,对AIA22进行定点设计和改造,并评价其结合活性、中和活性、稳定性、代谢特征等分子特性,最终筛选获得对多亚型IFNα亲和力和中和活性明显提高的候选抗体分子,整体中和活性达到甚至超过对照抗体Sifalimumab的水平。首先,我们对AIA22轻重链CDR区进行了丙氨酸扫描,并通过ELISA方法鉴定丙氨酸扫描突变体对IFNa-1b和IFNa-2b的结合活性变化,结果揭示了抗原抗体相互作用的关键信息,为同源模建和分子对接方法构建的抗原-抗体复合物结构模型提供了实验数据支持。基于对复合物结构模型的分析,发现AIA22和IFNa-Ib亲和力低的可能原因是AIA22与IFNa-1b相互作用界面存在明显的结构冲突(重链Y99与IFNα-1b的LoopAB区)。结合丙氨酸扫描的结果,以改变冲突位点局部构象为目的,我们设计了一系列突变体抗体,ELISA鉴定其结合活性的变化,同时对结合活性显著改善的突变位点进行选择组合。采用ELISA和forteBio系统就组合突变体对IFNα-1b和IFNα-2b的亲和力及动力学特性进行鉴定,获得多个对IFNα-1b结合活性有改善对IFNa-2b结合活性不降低的突变体抗体。进一步地,对突变体抗体进行体外中和活性的鉴定,并最终获得对多个IFNa亚型中和活性明显提高的突变体抗体分子L-S34A+H-32G96W(命名为AIAmut)。相比于亲本抗体AIA22, AIAmut对IFNa-1b、2a、2b、4b、5、10、16、17、21的中和活性有不同程度的提高,对IFNα-6、8的中和活性基本保持不变,对IFNa-14中和活性降低明显。整体而言,AIAmut对IFNα中和活性有明显的提升。相比于对照抗体Sifalimumab,突变体抗体AIAmut在保证对IFNa-2b中和活性优势的前提下,对IFNα-4b、5、10、16、17、21的中和活性也达到Sifalimumab水平；对IFNα-1b的中和活性已接近Sifalimumab;对IFNα-6,8,14的中和活性与Sifalimumab仍存在较大差距。在基于结构模建进行分子设计的同时,我们成功结晶了AIA22-Fab/IFNα-2b复合物,并解析获得晶体结构信息。基于复合物晶体结构,以AIAmut为基础,我们设计了一系列突变体抗体分子。首先,我们构建了突变体抗体分子,并利用forteBio系统对突变体进行鉴定,比较突变体抗体分子对IFNα-lb的亲和力与结合特征的变化。对优选的突变体抗体分子,进一步检测其对IFNa-2b的亲和力与结合特征的变化。淘汰对IFNa-2b结合活性明显降低的突变体,最终得到W2S1A7、W2A7、W2A10、W2A11、S1A7、S1A10、S1A11、VV3共计8个候选突变体抗体分子。进一步地,我们以表达水平、稳定性和中和活性等为评价指标对8个候选抗体分子进行优选。稳定性评价方面,以4℃放置样品为标准品,分别以重组IFNα-1b-His、IFNα-2b-His和IFNα-4a-His为目标抗原,比较分析室温和37℃条件下于血清和pH6.5 PBS缓冲液中放置的各突变体抗体的结合活性,进而评价其稳定性。结果表明,除W3和SIA11的结合活性表现明显低于其他突变体及AIAmut外,其他突变体稳定性均好于AIAmut。考虑W3的表达水平明显低于其他突变体,直接淘汰W3。同时,结合各突变体抗体对IFNa-1b和IFNa-2b中和活性的初步评价结果,优选出W2S1A7、W2A7和W2A10三个突变体抗体分子。与AIAmut相比,三个突变体抗体分子对IFNα-1b和FNα-2b的中和活性均有提高,特别是对IFNa-1b的中和活性提升明显,达到甚至优于Sifalimumab的水平。就三个候选抗体分子对各亚型IFNa的中和活性进行全面评价,结果表明,W2S1A7和W2A7对各亚型IFNa整体(除IFNa-14外)的中和活性提升更为明显。具体地,W2S1A7和W2A7对IFNα-2b、4a、21的中和活性优于Sifalimumab;对IFNα-1b、5、8、10、16、17的中和活性与Sifalimumab相当；对IFNa-6的中和活性有明显提高,但与Sifalimumab相比仍然存在较大差距；对IFNa-7仍无中和活性；相比于AIAmut,突变体抗体分子对IFNa-14的中和活性存在明显降低。Babl/C小鼠的体内的代谢特征评价结果表明,W2SIA7和W2A7体内半衰期均不低于120小时。相比之下,W2S1A7最高血药浓度及半衰期均优于W2A7,因此,我们最终确定W2S1A7为候选抗体药物分子。
[Abstract]:The results showed that AIA22 and IFNa - 1b had a significant lower affinity than that of the control antibody . The results showed that AIA22 had a significant lower affinity to IFNa - 1b .
On the basis of structural modeling , we have successfully crystallized AIA22 - Fab / IFN伪 - 2b complexes .
The neutralization activity of IFNa - 6 is obviously improved , but there is still a great gap compared with Sifpea ;
the IFNa - 7 still has no neutralizing activity ;
In comparison with AIAmut , there was a significant decrease in the neutralizing activity of the mutant antibody molecule to IFNa - 14 . In the body of Babl / C mice , the half - life of W2SIA7 and W2A7 was not less than 120 hours . In contrast , the highest plasma concentration and half - life of W2S1A7 were better than that of W2A7 , so we finally determined that W2S1A7 was a candidate antibody drug molecule .

【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.241

【参考文献】