小胶质细胞在热射病小鼠早期中枢神经系统炎症发生中的作用研究

发布时间：2018-04-13 17:27

本文选题：热射病 + 中枢神经系统炎症　；参考：《第三军医大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景和意义热射病(heat stroke:HS),即重症中暑,是一种常见的急症。主要表现为体温急剧升高,超过40℃,皮肤出现干燥和灼热,伴有明显中枢神经系统受损症状。重症患者若未能及时有效控制,则迅速发展为全身多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),死亡率可达30-50%。近年来,因全球气候变暖,我国军人在热区进行训练、野战演习和执行任务时中暑的发生率明显增加,往往由于部队训练及执行任务的地区条件较艰苦,医疗水平较为落后,故死亡率更高。因此研究热射病发生机理,探索新的治疗策略和措施,提高热射病的救治成功率,对维护军人以及特殊职业人群的身体健康,保障部队的战斗力具有重要的作用和意义。热射病的急性期中枢神经损害为其主要症状表现,也是诊断热射病的主要依据。有关热射病中枢神经损伤的机理目前已有较多文献报道,研究表明热射病时高温对中枢神经系统产生直接损伤作用,可造成脑细胞发生一系列病理生理效应。还有研究认为热射病时脑损伤的主要病理生理基础是脑缺血、缺氧,可导致中枢神经细胞继发性损伤。然而,除了高热,以及缺血、缺氧等因素外,在热射病的发生发展中,中枢神经炎症反应也具有重要的作用。热射病患者的很多临床资料研究结果提示脑组织发生了明显炎症反应。利用热射病动物模型,很多研究者发现热射病可引起中枢神经系统促炎因子IL-1、IL-6等大量生成,炎症因子的升高与神经系统的损伤、血管水肿以及神经元死亡有明显相关性。但是,关于热射病过程中中枢神经炎症反应发生、发展以及转归的主要机制目前还缺乏深入认识,因此也导致临床救治热射病过程中没有充分认识中枢神经炎症的重要性。中枢神经系统炎症反应的发生及发展与小胶质细胞密切相关。小胶质细胞在中枢神经系统中广泛分布,在中枢神经系统中起到营养、支持、抗原递呈和组织修护等作用,也是中枢神经系统免疫反应的主要介质,在中枢神经系统的病理和生理过程中起到至关重要的作用。小胶质细胞在中枢神经系统炎症中具有双重作用。一方面小胶质细胞具有抗炎作用,可通过吞噬细胞碎片、释放抗炎因子以及神经生长因子来减轻神经系统损伤,并促进组织恢复。另一方面小胶质细胞活化可释放高水平的细胞毒性物质和促炎因子,造成神经元失能和神经细胞死亡。近年来研究明确小胶质细胞这种双重作用主要和小胶质细胞激活后的活化表型有关,当中枢神经系统受到各种病理刺激时小胶质细胞迅速发生活化,活化后小胶质细胞主要表现为两种不同活化表型:M1活化表型与M2活化表型。M1型活化的小胶质细胞主要分泌促炎因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、NO等,发挥促进炎症反应、抑制吞噬功能等神经毒性作用。M2型活化的小胶质细胞主要分泌抑炎因子IL-4、IL-10、IL-13、转化生长因子β(TGF-β)、精氨酸酶(Arg1)以及神经营养因子等,主要发挥免疫调节、抑制炎症、维持吞噬、促进修复和再生等神经保护作用。由此,我们推测热射病过程中中枢神经系统炎症反应的发生发展与小胶质细胞激活后呈现不同的活化表型相关。因此,本课题通过建立小鼠热射病模型,观察小胶质细胞在热射病小鼠早期中枢神经系统炎症发生的变化,研究热射病小鼠脑组织中小胶质细胞活化表型的变化情况,并采用离体细胞模型初步探讨热射病过程中影响小胶质细胞活化表型变化的因素,以揭示小胶质细胞在热射病中导致中枢神经系统炎症反应中的作用,为以后临床上通过采用调节小胶质细胞活化来救治热射病提供实验室依据。研究方法1、采用12周龄的BALB/c 12健康雄性小鼠,重量为(29.1±0.6)g,小鼠置于高温环境智能模拟实验舱,温度(41.2±0.5)℃,相对湿度(60±2)%,加热至直肠温度达到(42.4±0.2)℃建立热射病小鼠模型。将小鼠随机分为正常对照组(CON),热射病组(HS),热射病组又分为热射病1 h组(HS-1h)、热射病3 h组(HS-3h)、热射病6 h组(HS-6h)、热射病12 h组(HS-12h)、热射病24 h组(HS-24h)。对比观察舱室内及出舱后Tre变化和生存率情况,以及不同热射病组小鼠体质量的变化,利用HE染色观察大脑组织病理变化。通过实时定量荧光PCR(quantitative real-timePCR,q PCR)和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组小鼠大脑皮层及海马TNF-α、IL-1β和IL-6基因及蛋白表达,探讨热射病后各恢复时相点大脑炎症的变化情况。2、通过qPCR检测各组小鼠大脑皮层M1极性活化标志物CD45、CD16和CD11bm RNA和M2极性活化标志物Arg1(Arginase 1,精氨酸酶)、FIZZ(found in inflammatory zone,发现于炎症区域)和CD206 m RNA的相对表达水平。Western Blot检测各组小鼠大脑皮层M1极性活化标志物蛋白CD45、CD11b和M2极性活化标志物蛋白FIZZ、CD206的表达水平。免疫组织荧光观察M1极性活化标志物CD45和M2极性活化标志物CD206表达情况,探讨热射病后不同时间点大脑皮层小胶质细胞活化表型的表达规律。3、通过体外培养BV-2小胶质细胞以及BV-2与PC12神经细胞transwell共培养的细胞模型,采用热应激及脂多糖(LPS)刺激,采用ELSA检测各种条件下培养液中炎症因子TNF-α、IL-1β的浓度,明确热应激后小胶质细胞促炎反应的规律。用q-PCR、流式细胞术以及免疫组织荧光标记观察各种条件和刺激模型中BV-2小胶质细胞M1极性活化标志物CD11b、CD45和M2极性活化标志物FIZZ、CD206 m RNA、蛋白质表达量在不同时间点的相对表达水平揭示热应激及LPS对单独或共培养条件下BV-2小胶质细胞活化表型的影响,初步探讨对热射病过程中触发小胶质细胞活化的主要机制。结果1、在(41.2±0.5)℃、湿度(60±2)%环境中持续暴露至小鼠Tre达(42.4±0.2)℃建立了小鼠热射病模型。出舱后HS-1h组小鼠Tre体温明显降低,表现为低体温期,HS-24h组小鼠Tre略高于CON组,表现为发热期;HE染色观察到在热射病后恢复1h小鼠观察到细胞周围水肿、血管周围水肿、细胞核固缩裂解、内质网紊乱等,其后随时间延长损伤程度逐步减轻。表明热应激导致小鼠中枢神经细胞出现明显病理变化,热射病中枢神经损伤小鼠模型成功建立。HS-1h组、HS-3h组小鼠大脑皮层和海马炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达及蛋白合成明显增多,与CON组比较差异明显(P0.0001),HS-24h组小鼠大脑皮层和海马炎症因子与CON组无明显差异(P0.05)。提示热射病恢复期内中枢神经系统有明显炎症反应,以恢复期1h最为严重,到24h后基本恢复正常水平。2、热射病小鼠大脑皮层M1极性活化标志物CD45、CD16和CD11b的m RNA表达水平在热射病恢复后1 h迅速升高(P0.01),到24 h后m RNA表达水平基本恢复至CON组水平(P0.05)。小鼠大脑皮层M2极性活化标志物Arg1、FIZZ和CD206的m RNA表达水平在热射病恢复3h开始明显增加(P0.001),后随时间延长逐渐升高,到24h后达到最高(P0.0001)。皮层M1及M2极性活化标志物蛋白表达水平基本与m RNA表达的变化规律相似。免疫组织荧光观察M1极性活化标志物CD45,热射病后恢复1h标记明显,M2极性活化标志物CD206在热射病后恢复24h标记明显。3、热应激刺激BV-2小胶质细胞后,检测到到炎症因子TNF-α、IL-1β含量明显升高(P0.0001),后逐渐降低,24 h后仍然高于对照组(P0.0001)。热刺激后1-3h BV-2小胶质细胞M1极性活化标志物CD45、CD11b mRNA表达水平显著高于对照(P0.0001),其后略有下降,24 h仍维持高表达水平(P0.01);而M2标志物CD206、FIZZ mRNA相对表达水平在热应激后3 h出现表达高峰(P0.01),其它时相组与对照无明显差异(P0.05)。流式细胞检测M1及M2标志物CD45与CD206蛋白质在热应激1 h与24 h的表达,结果基本与mRNA相似。免疫荧光观察到CD45在恢复1h表达增多,至24 h基本降低至CON组水平,CD206在恢复1 h至24 h基本无明显变化。BV-2小胶质细胞与PC12神经细胞transwell共培养的细胞模型,观察发现热应激后小胶质细胞M1极化标志物CD45、CD11bmRNA相对表达水平在1 h时表达最高(P0.0001),之后逐渐下降,24 h后与对照无明显差异(P0.05)。M2极化标志物FIZZ、CD206 m RNA相对表达水平的表达量在在热应激3-6h开始升高,到24 h达到最高(P0.0001);流式细胞术检测M1极化标志物CD45与的M2极化标志物CD206蛋白表达量,其变化趋势与m RNA基本一致。免疫荧光观察CD45在恢复1 h时少量增加,恢复至24 h时降至CON组水平。CD206在恢复1 h变化不明显,恢复至24 h增加显著。LPS刺激后1-3 h BV-2小胶质细胞M1极化标志物CD45、CD11bm RNA表达水平明显升高(P0.0001),24 h后达到峰值(P0.0001);M2极化标志物CD206在刺激后1-12 h变化与对照组比较无明显差异,M2极化标志物FIZZmRNA相对表达水平在LPS刺激后1-3h变化不明显,6 h-24 h反而明显低于对照组。流式细胞术检测M1极化标志物CD45及M2标志物CD206蛋白质在热应激1 h与24 h的表达,结果与m RNA表达变化基本相似。免疫荧光观察到CD45持续增加,至24 h达到最高。CD206在1 h无明显变化,至24 h降低。全文结论1、热射病后恢复期1h-3h内中枢神经系统出现明显的炎症反应,病理损伤最重,之后随着时间延长逐渐减轻,至24h基本趋于恢复,提示中枢神经炎症与热射病中枢神经损伤密切相关。2、热射病可诱导小鼠脑组织小胶质细胞活化,其活化的规律表现为热射病后1h-3h主要表现为M1型极化,而在热射病后24h则主要表现为M2型极化,结果表明热射病后小胶质细胞由M1型向M2型转化这种变化形式可能是热射病中枢神经炎症发生发展的主要原因。3、热应激可明确激活小胶质细胞,并主要表现为M1型极化,而后期小胶质细胞活化表型向M2转化则可能和小胶质细胞所处微环境有关,LPS刺激小胶质细胞活化表型的变化形式与热应激刺激并不相同,结果提示热射病后中枢神经炎症以及小胶质细胞活化表型的变化基本与外周血中LPS无关。
[Abstract]:In recent years , many researchers found that the main pathological physiological basis of heat injection is cerebral ischemia and hypoxia , which can lead to secondary injury of central nervous system . In recent years , microglia cell activation can release high - level cytotoxic substances and pro - inflammatory factors . It is suggested that microglial cells can release high - level cytotoxic substances and pro - inflammatory factors . The expressions of TNF - 伪 , IL - 1尾 and IL - 6 in cerebral cortex and hippocampus of mice were detected by means of real - time quantitative real - time PCR ( PCR ) and enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA ) . There was no significant difference between the expressions of TNF - 伪 , IL - 1尾 and IL - 6 in cerebral cortex and hippocampus in HS - 3h group ( P0.05 ) . The expression level of CD206 protein in mouse brain tissue was significantly higher than that of control group . The expression level of CD206 protein in 1 - 3 h BV - 2 microglial cell was significantly higher than that in control group .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R594.12

【参考文献】