高磷血症致胆固醇敏感器SCAP功能失调促进动脉粥样硬化的分子机制研究

发布时间：2018-04-17 01:33

本文选题：动脉粥样硬化 + 高磷血症　；参考：《重庆医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：第一部分高磷血症通过诱导SCAP功能失调促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化目的:高磷血症是慢性肾脏病患者动脉粥样硬化性心血管疾病的重要危险因素,其促进动脉粥样硬化的分子机制不清楚。固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)裂解激活蛋白(SCAP)是细胞内的胆固醇敏感器,在反馈性调节细胞内胆固醇稳态平衡中具关键作用。多项研究表明:病理状态下SCAP功能失调可致多种外周细胞内胆固醇异常聚集。本实验拟通过建立ApoE-/-小鼠高磷血症模型,探讨高磷状态下胆固醇敏感器SCAP功能状态对动脉粥样硬化的影响及其分子机制。方法:8周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为:正常饮食组(Chow组,含磷0.6%,n=8)、高磷饮食组(h P组,含磷1.6%,n=8)组、高磷饮食联合司维拉姆组(h PS组,n=12)以及高磷血症司维拉姆治疗组(h PST组,n=8)。高磷饮食联合司维拉姆组给予含有3%碳酸司维拉姆的高磷饮食,高磷血症司维拉姆治疗组则先给予高磷饮食喂养8周成功建立高磷血症,再继续给予含有3%碳酸司维拉姆的高磷饮食。SPF级喂养共16周时处死小鼠,检测血钙、磷、尿素氮、血脂等生化指标,制备主动脉连续冰冻切片并行油红O染色评价粥样硬化斑块负荷,行免疫组化染色以及Western blot检测SCAP、SREBP2、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCo AR)和低密度脂蛋白受体(LDLr)水平。结果:高磷饮食喂养8周时,ApoE-/-小鼠血磷水平显著高于普通饮食组,表明小鼠已出现高磷血症。喂养16周时,高磷饮食组小鼠血磷仍显著高于普通饮食组(P0.05),高磷饮食联合司维拉姆组小鼠血磷较高磷饮食组明显降低(P0.05),但高磷血症司维拉姆治疗组血磷仍显著高于普通饮食组,且与高磷饮食组比较无差别。血尿素氮、血脂等指标在四组小鼠间无显著差异。主动脉根部连续冰冻切片油红O染色及斑块定量分析显示:高磷饮食组小鼠粥样斑块负荷(以斑块面积/血管截面积表示)显著大于正常饮食组和高磷饮食联合司维拉姆组(P0.05),但与高磷血症司维拉姆治疗组相比无统计学差异。免疫组织化学染色与Western blot检测结果表明:高磷饮食组与高磷血症司维拉姆治疗组小鼠N-SREBP2、HMGCo AR、LDLr及SCAP蛋白水平明显高于普通饮食组及高磷饮食联合司维拉姆组。结论:高磷血症通过上调血管组织细胞内SCAP蛋白水平,使其异常运载SREBP2从内质网至高尔基体并经酶解释放其氨基端片段N-SREBP2,后者转位入核并与其靶基因启动子上游的SRE结合,上调LDLr与HMGCo AR等靶基因的转录,促进血浆中LDL经LDLr摄入细胞内,同时增加细胞内源性胆固醇合成,最终促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生与发展。口服磷结合剂碳酸司维拉姆可有效预防高磷饮食引起的高磷血症并减轻动脉粥样硬化病变,但在已形成持续高磷血症的小鼠,碳酸司维拉姆干预效果不理想,这可能与持续高磷血症激活PTH、FGF-23等代偿机制有关。第二部分高磷环境下胆固醇敏感器SCAP功能失调促进巨噬细胞内胆固醇蓄积目的:观察高磷环境对巨噬细胞内胆固醇积聚的影响与分子机制。方法:将PMA诱导的THP-1源性巨噬细胞分为对照组(磷1.0mmol/L)、高磷处理组(磷3.0 mmol/L)、磷甲酸钠(PFA)处理组(PFA1.0 mmol/L)以及高磷联合PFA处理组,无血清培养基中处理24小时后,油红O染色观察细胞内中性脂质分布,酶法定量测定细胞内胆固醇含量,Real time-PCR法测细胞内羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCo AR)、低密度脂蛋白受体(LDLr)、固醇调节原件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)m RNA表达,Western blot法测定细胞内SCAP、LDLr、HMGCo AR及核内固醇调节原件结合蛋白2(N-SREBP2)蛋白水平。结果:与对照组相比,高磷处理组巨噬细胞内中性脂质明显聚集,高磷处理可显著增加细胞内总胆固醇与胆固醇酯的含量(P0.05),这种作用可被细胞表面钠磷转运体pit-1的特异性阻断剂PFA所阻断(高磷联合PFA处理组)(P0.05)。高磷处理组巨噬细胞LDLr、HMGCo AR m RNA与蛋白表达水平均明显高于对照组(P0.01),同时细胞核内N-SREBP2水平也明显增高,加入PFA(高磷联合PFA处理组)可抑制上述效应。进一步研究发现:高磷处理组巨噬细胞内控制SREBP2转位激活的关键伴侣分子SCAP蛋白水平明显增高(P0.05),但其m RNA表达在各组间无显著差异(P0.05),上述变化可被PFA阻断。结论:高磷环境下,钠磷转运体Pit-1介导磷离子进入巨噬细胞内,并通过基因转录后机制增加胆固醇敏感器SCAP蛋白水平,诱导其功能失调,促使其从内质网异常转运SREBP2至高尔基体进行裂解激活,产生过多N-SREBP2,后者转位入核促进HMGCo AR和LDLr表达,使细胞内源性胆固醇合成和外源性LDL经LDLr摄入增加,最终导致细胞内胆固醇异常集聚。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of SCAP function on atherosclerosis in patients with chronic renal disease by inducing SCAP dysfunction : hyperphosphatemia is an important risk factor for atherosclerotic cardiovascular disease in chronic renal disease . Results : The levels of SCAP protein in high - phosphorus diet group were significantly higher than those in normal diet group and high - phosphorus diet group ( P0.05 ) . The results showed that the level of intracellular total cholesterol and cholesterol ester was significantly higher than that of the control group ( P0.05 ) . The results showed that the level of intracellular total cholesterol and cholesterol ester was significantly increased in high P treatment group ( P0.05 ) .

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.5;R589

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