mDial在晚期糖基化终产物介导的内皮细胞通透性增高中的作用

发布时间：2018-04-24 05:05

  本文选题：晚期糖基化终产物 + mDia1　； 参考：《南方医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)是蛋白质赖氨酸的氨基和还原糖的醛基之间发生非酶性糖基化反应,形成Schifi碱,经Amadori反应并重排后形成相对稳定终产物的总称。AGEs与糖尿病及其并发症的发生发展密切相关,尤其是在血管通透性中起着重要作用,本实验室前期工作已证实AGEs通过与其特异性受体RAGE结合,通过氧化应激等信号转导机制,影响肌动蛋白的组构及内皮细胞钙依赖性粘附蛋白、VE-cadherin结构形态的改变,引起内皮细胞收缩,导致内皮细胞通透性增高,从而导致血管通透性增高。Diaphanous相关成蛋白(Diaphanous—related formins,DRF)族成员因具有两个特殊的功能结构域,GTP酶结合结构域(GT—Pase binding domain, GBD)和Diaphanous自调节结构域(Diaphanous.autoregulatory domain, DAD)而被划分为formins家族的一个亚类,广泛分布于从酵母到哺乳动物等各种真核细胞中,mmDial是其中的一员,之前研究证明该亚家族对细胞黏附、运动、胞质的分裂、形态的发生、细胞极性的形成、血清反应因子的激活等起重要调控作用,而近期有研究显示,mDial的FH1段可以与RAGE胞浆段结合,在转化的细胞株中,RAGE配体介导的细胞迁移是需要mDial参与的：另外,在配体刺激下,RAGE可通过与mDial相互结合并引发氧化应激从而参与心血管疾病的发生发展。本实验室前期已证实的AGEs通过与RAGE结合,进而通过氧化应激等信号转导机制影响VE-cadherin结构形态的的改变,但RAGE与氧化应激之间没有直接作用关系。据此我们推测,AGEs通过其配体RAGE结合激活mDial,并进而引发氧化应激导致下游相应信号分子活化,最终介导HUVECs通透性增高。研究目的：本研究旨在阐明mDial是否参与AGEs介导的HUVECs通透性增高,并探讨其具体机制。方法：实验中主要的研究对象为人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)。采用原代分离、细胞培养、免疫印迹、免疫荧光、流式细胞术、siRNA干扰、转染质粒、腺病毒、跨内皮细胞电阻测定同时应用FITC标记的右旋糖酐检测通透性等方法,观察AGEs刺激下HUVECs氧化应激水平、酪氨酸激酶Src磷酸化水平、内皮细胞钙依赖性粘附蛋白VE-cadherin磷酸化水平以及VE-cadherin分布变化等情况。AGE修饰的牛血清白蛋白(AGE-modified bovineserum albumin AGEs),由牛血清白蛋白D-葡萄糖共孵育8周制得。原代分离人脐静脉内皮细胞HUVECs并于体外培养,接种于3.5cm、6cm、10cm培养皿、微孔小皿(petri dish)、双层通透的培养皿(transwell)顶层小室微孔膜上(直径6.5mmm,孔径大小0.4大小),待细胞长至融合或接近融合时,换无血清培养基继续培养2h,使细胞获得同步生长,然后按实验分组分别处理备用。构建RAGE野生型及突变质粒；选用mDial siRNA以及干扰与过表达型腺病毒,经脂质体转染以及感染HUVECs48h后,继以AGEs 100mg/L孵育,用流式细胞仪检测活性氧产生；蛋白免疫印迹检测Src与VE-cadherin的磷酸化,采用多功能蛋白组学影像系统直接成像,以Image J软件分析各组灰度值,β-actin为内参进行校正,以对照组面积灰度值为100%与实验组进行比较；用电阻仪测定跨内皮细胞单层电阻(Trans Endothelial Electrical Resistance, TER),并同时用FITC标记右旋糖酐漏出法测定单层内皮细胞的通透系数(Pa,apparent permeability coefficient);用免疫荧光染色法、激光共聚焦显微镜观察内皮细胞VE-cadherin的形态改变情况。结果：1.AGEs介导HUVECs通透性增高,mDia1参与其中。(1) AGEs通过其受体RAGE介导HUVECs通透性增高。给予AGEs刺激8h,HUVECs TER显著下降,与0h相比,差异具有统计学意义,同时FITC-dextran漏出显著增多,与不加刺激组相比,差异具有统计学意义。而预转染RAGE siRNA和control siRNA 48h后,再给予AGEs 100mg/L刺激8h,用电阻仪检测TER,同时以FITC-dextran漏出法测Pa。结果显示,与予AGEs刺激组相比,预转染RAGE siRNA组的TER下降幅度明显降低、FITC-dextran漏出明显减少,control siRNA则无明显改变。结果提示：AGEs通过其受体RAGE导致HUVECs通透性增高。(2) mDia1参与了AGEs介导的HUVECs通透性增高。分别预转染mDia1 siRNA和control siRNA、感染mDia1干扰型、过表达型及相应对照腺病毒48h后,再给予AGEs100mgL刺激8h,用电阻仪检测TER,同时以FITC-dextran漏出法测Pa。结果显示,与AGEs刺激组相比,预转染mDia1 siRNA组与感染mDia1干扰型腺病毒组的TER下降幅度明显降低、FITC-dextran漏出明显减少,control siRNA及对照腺病毒则无明显改变：而感染了mDia1过表达型腺病毒组与.AGEs刺激组相比,TER下降幅度明显增大、FITC-dextran漏出明显增多,感染对照腺病毒组则无明显改变。结果提示：mDial在AGEs介导的HUVECs通透性增高中起作用,且与该过程正相关。(3) mDia1通过与RAGE结合参与AGEs介导的HUVECs通透性增高。构建RAGE的野生型及突变型真核表达质粒,突变型质粒即突变RAGE的结合位点,tRAGE第五位精氨酸与第六位谷氨酰胺均突变为丙氨酸。分别用脂质体法对HUVECs转染RAGE野生型质粒、突变型质粒以及对照空载质粒,48h后再给予AGEs刺激8h,结果显示,与AGEs刺激组相比,预转染RAGE突变质粒组TER下降明显降低,FITC-dextran漏出明显减少；而转染了RAGE过表达质粒组与AGEs刺激组相比,TER下降幅度明显增大、FITC-dextran漏出明显增多,感染对照空载质粒组则无明显改变。结果提示：mDia1是通过与RAGE结合参与到AGEs介导的HUVECs通透性增高这一过程中。2. AGEs通过激活NADPH氧化酶4导致HUVECs ROS水平增高,最终导致HUVECs通透性增高,mDial通过与RAGE相互作用参与其中。(1) AGEs通过激活NADPH氧化酶4导致HUVECs ROS水平增高。AGEs刺激HUVECs,流式细胞仪检测HUVECs活性氧ROS产生水平,结果显示：100mg/L AGEs能以时间依赖性导致HUVECs ROS产生增加,与对照组相比,10min时差异即有统计学意义,15mmin差异最明显,到刺激30min差异仍有统计学意义。而预转染NADPH氧化酶4的siRNA 48h后再用AGEs刺激HUVECs,与AGEs刺激组相比,活性氧ROS产生水平明显减少,差异具有统计学意义；control siRNA与相应对照组相比,差异无统计学意义。结果提示AGEs通过激活NADPH氧化酶4导致HUVECs ROS水平增高。(2) mDial通过与RAGE相互作用参与了AGEs介导的HUVECs活性氧水平增高。分别预转染mDial siRNA和control siRNA^感染mDial干扰型、过表达型及相应对照腺病毒48h后,再给予AGEs 100 mg/L刺激HUVECs,15min后检测ROS水平,结果显示：与AGEs刺激组相比,预转染mDial siRNA组与感染mDial干扰型腺病毒组的ROS产生明显减少,control siRNA及对照腺病毒与相应对照组相比则无明显改变；而感染了mDial过表达型腺病毒组与AGEs刺激组相比,ROS产生明显增多,感染对照腺病毒组与相应对照组相比则无明显改变。预转染RAGE野生型质粒、突变型质粒以及对照空载质粒,48h后再以AGEs刺激HUVECs,15min后检测ROS水平,结果显示：与AGEs刺激组相比,预转染RAGE突变质粒组ROS产生明显减少；而转染了RAGE过表达质粒组与AGEs刺激组相比ROS产生明显增多,感染对照空载质粒组与相应对照组相比则无明显改变。结果提示：mDial参与了AGEs介导的HUVECs活性氧水平增高,且通过与RAGE结合发挥作用。(3) AGEs刺激HUVECs,导致Nox4膜富集(转位),mDial通过与RAGE结合参与其中。AGEs刺激HUVECs相应时间后,提取膜蛋白,采用Western blotting方法检测Nox4表达,结果显示,AGEs刺激HUVECs 15min时,膜蛋白中Nox4表达最高,提示AGEs刺激HUVECs可导致Nox4膜转位,进而使氧化应激水平增加；预转染RAGE野生型质粒、突变型质粒以及对照空载质粒,48h后再以AGEs刺激HUVECs,15min后提取膜蛋白,Western blotting检测Nox4表达,结果显示,与对照组相比,转染野生型RAGE质粒组Nox4在膜上表达增多,而转染RAGE突变型质粒组Nox4表达减少,提示AGEs刺激HUVECs可导致Nox4膜转位,mDial通过与RAGE结合参与其中。(4)Nox4参与了AGEs导致的HUVECs通透性增高中。预转染Nox4 siRNA和control siRNA48h后,再给予AGEs 100 mg/L刺激8h,用电阻仪检测TER,同时以FITC-dextran漏出法测Pa。结果显示,与AGEs刺激组相比,预转染Nox4 siRNA组的TER下降幅度明显降低、FITC-dextran漏出明显减少,control siRNA则无明显改变。结果提示：Nox4参与了AGEs导致的HUVECs通透性增高中。3.AGEs通过RAGE导致HUVECs Src Y419磷酸化水平增高,mDial通过与RAGE结合参与其中。AGEs 100mg/L刺激HUVECs相应时间,提取总蛋白,Western blotting检测酪氨酸激酶Src Y419磷酸化水平。结果显示：AGEs能呈时间依赖性导致SrcY419磷酸化水平增高。而预转染RAGE siRNA、mDial siRNA及感染mDial干扰型腺病毒48h后再给予AGEs刺激,与AGEs刺激组相比,转染RAGE siRNA、 mDial siRNA及感染mDial干扰型腺病毒组SrcY419磷酸化水平明显降低,感染mDial过表达腺病毒组SrcY419磷酸化水平明显增高；预转染RAGE野生型质粒48h后再给予AGEs刺激,与AGEs刺激组相比,Src磷酸化水平明显增高,而转染RAGE突变型质粒组Src磷酸化水平明显降低。结果提示：AGEs通过RAGE导致HUVECs SrcY419磷酸化水平增高,mDial通过与RAGE结合在其中发挥作用。4..氧化应激参与AGEs导致的HUVECs Src Y419磷酸化水平增高。预先孵育NADPH氧化酶抑制剂Apocynin 40min以及预转染Nox4 siRNA48h后再以AGEs 100mg/L刺激HUVECs,提取细胞总蛋白,Western blotting检测SrcY419磷酸化水平。结果显示：与AGEs刺激组相比,抑制剂Apocynin组及Nox4 siRNA组Src Y419磷酸化水平明显降低。结果提示：氧化应激参与AGEs介导的HUVECs Src Y419磷酸化水平增高中,证明氧化应激在Src上游发挥作用。5. AGEs导致HUVECs VE-cadherin Y658磷酸化水平增高,mDial通过与RAGE结合参与其中。AGEs 100mg/L刺激HUVECs相应时间,提取总蛋白,Western blotting检测VE-cadherinY658磷酸化水平。结果显示：AGEs能呈时间依赖性导致VE-cadherinY658磷酸化水平增高。而预转染mDial siRNA 48h后再给予AGEs刺激,与AGEs刺激组相比,VE-cadherinY658磷酸化水平明显降低。预转染RAGE野生型质粒48h后再给予AGEs刺激,与AGEs刺激组相比,VE-cadherinY658磷酸化水平明显增高,而转染RAGE突变型质粒组VE-cadherinY658磷酸化水平明显降低。结果提示：AGEs可以导致HUVECs VE-cadherinY658磷酸化水平增高,mDial通过与RAGE结合在其中发挥作用。6. mDia1、RAGE、Nox4均参与AGEs介导的HUVECs VE-cadherin形态结构改变。(1) AGEs介导HUVECs VE-cadherin形态结构改变。AGEs 100mg/L刺激HUVECs,不加刺激为对照组,8h后进行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察内皮细胞钙依赖性粘附蛋白、VE-cadherin的形态结构改变情况。结果显示,正常对照组的内皮细胞VE-cadherin存在于细胞周边呈环状,线条清晰连续,细胞间连接紧密,无明显缝隙；AGEs刺激后VE-cadherin线条呈断裂锯齿状,甚至出现中断,边缘也变得十分粗糙。结果提示：AGEs可以介导内皮细胞VE-cadherin形态结构改变。(2) mDia1、RAGE、Nox4均参与AGEs导致的HUVECs VE-cadherin形态结构改变中。预转染RAGE siRNA、mDial siRNA、Nox4 siRNA、mDial干扰型和过表达型腺病毒以及RAGE野生型与突变型质粒48h后,给予HUVECs 100mg/L AGEs刺激,8h后进行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察内皮细胞钙依赖性粘附蛋白VE-cadherin的形态结构改变情况。结果显示,与AGEs刺激组相比,RAGE siRNA、mDial siRNA、Nox4 siRNA、mDial干扰型腺病毒以及RAGE突变型质粒组VE-cadherin形态结构改变明显减轻,而mDial过表达腺病毒组及RAGE野生型质粒组VE-cadherin线条中断,破坏严重,甚至失去原来形态。结果证明：mDial、 RAGE、Nox4均参与AGEs导致的HUVECs VE-cadherin形态结构改变中。结论：1. AGEs通过与其受体RAGE结合导致HUVECs通透性增高,mDial通过与RAGE相互作用参与其中。2.AGEs通过与其受体RAGE结合导致HUVECs发生氧化应激,mDial通过与RAGE相互作用参与其中。3.AGEs通过mDial引发氧化应激而激活酪氨酸激酶Src,表现为Src第419位酪氨酸磷酸化。4.AGEs可介导内皮细胞钙依赖性粘附蛋白VE-cadherinY658发生磷酸化,mDial通过与RAGE相互作用参与其中。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1
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本文编号：1795250