BAFF抑制自身免疫性疾病中IL-15表达的作用机制研究
发布时间：2018-04-29 02:44
本文选题：BAFF + IL-15 ； 参考：《吉林大学》2015年博士论文
【摘要】：背景： B细胞不仅能够产生致病性抗体，而且它们还具有多样的效应功能，包括抗原的摄取、转运，抗原递呈到T细胞，细胞因子和趋化因子的产生，以及迁移至炎症部位，所以B细胞已经成为自身免疫性疾病的“罪魁祸首”。BAFF是调节B细胞成熟、存活和功能的决定性因素。在动物模型中，BAFF过表达能够导致自身免疫性疾病的发展；并且与正常健康人相比，自身免疫性疾病病人中BAFF的浓度均明显升高。在SLE中，BAFF的致病作用已经显示：BAFF转基因小鼠能够产生抗双链DNA（anti-double-strandedDNA，anti-dsDNA）抗体和发展成肾小球肾炎的狼疮样疾病。已有的研究表明：BAFF增加的水平与自身免疫性疾病的活动度具有相关性。在MS病人中，BAFF是通过星形胶质细胞来表达的，这些星形胶质细胞与存在于脑膜异位淋巴滤泡内的B细胞活化因子受体（B-cell activating factor receptor，BAFF-R）表达细胞具有密切联系。所以，BAFF已经成为了许多自身免疫性疾病的一个新的治疗靶点。BAFF抑制可造成CD20+幼稚B细胞的数目，活化B细胞和浆母细胞，结果导致了记忆B细胞数目的短暂增加。只要这种反应性记忆是持续存在的，那么原则上体液免疫反应就能够通过免疫记忆从而得以修复，因此研究BAFF调节记忆B细胞的机制是至关重要的。IL-15能够在抗原缺失的条件下提供维持记忆T细胞和B细胞存活的信号，但是BAFF是否能够通过调节B细胞中IL-15的表达从而影响自身免疫性疾病的发生和发展的作用机制尚不清楚。 目的： 探讨BAFF调节B细胞中IL-15表达的作用机制，证明BAFF抑制剂和抗IL-15抗体联合治疗能够成为彻底根治自身免疫性疾病和降低疾病复发率的有效治疗方案，并为临床应用提供了理论依据。 方法和结果： 1.我们对SLE、MS病人和它们的动物模型进行了研究，发现BAFF在自身免疫性疾病中的表达水平是增加的。我们应用TACI-IgG体内治疗EAE和狼疮样小鼠，以达到阻断BAFF的目的，应用流式细胞术（Fluorescence activated cell sorting，FACS）、酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，，ELISA）和实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time Quantitative PCR Detecting System，qPCR）进行检测，结果显示：EAE小鼠中，B细胞数目减少和自身抗原诱导的免疫反应减轻；狼疮样小鼠中，成熟B细胞数目和anti-dsDNA抗体滴度是降低的。另外，我们利用记忆B细胞分离试剂盒使用两步法分离小鼠中的记忆B细胞，通过计数每只小鼠的绝对记忆B细胞数目发现：在EAE和狼疮样小鼠中，TACI-IgG治疗能够明显上调记忆B细胞数目。这些结果表明接受贝利单抗或TACI-IgG治疗的病人，循环中记忆B细胞的总数目是相对恒定的，或者有的时候甚至是增加的，这与临床研究的结果是一致的。 2. IL-15是记忆T和B细胞生存和维持的重要细胞因子。因此，我们推断：在狼疮样小鼠中，TACI-IgG将BAFF封闭，从而通过诱导IL-15上调记忆B细胞。我们应用TACI-IgG体内治疗EAE和狼疮样小鼠，并从其中分离血清、脾和淋巴结，应用FACS、ELISA和qPCR方法检测发现：IL-15主要表达于脾脏中，TACI-IgG治疗能够上调IL-15表达；同时，我们也分离了TACI-IgG治疗的EAE和狼疮样小鼠的B细胞，同样发现TACI-IgG治疗能够上调B细胞中IL-15的表达。因此，我们推测TACI-IgG是否通过上调B细胞从而诱导IL-15的表达。在经过TACI-IgG治疗的EAE和狼疮样小鼠中，我们用anti IL-15抗体封闭了IL-15，发现记忆B细胞数目明显减少，这为BAFF抑制剂和抗IL-15抗体联合治疗自身免疫性疾病的临床应用提供了证据。 3.为了明确BAFF和APRIL对B细胞上IL-15表达的影响，我们使用自身抗原双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）联合BAFF或APRIL来刺激狼疮样小鼠的B细胞，应用qPCR和FACS方法分析显示：当dsDNA刺激狼疮样小鼠B细胞后，BAFF能够明显的抑制IL-15的表达，但APRIL却不能。我们使用MOG35 55（myelin oligodendrocyteglycoprotein，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白）联合BAFF刺激EAE小鼠B细胞，应用qPCR和FACS方法分析显示：在MOG35 55刺激EAE小鼠B细胞，BAFF明显抑制IL-15的表达。相比之下，BAFF也能够轻微地抑制野生型小鼠B细胞中IL-15的表达。另外，我们又使用了不同条件，如脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）或免疫球蛋白M抗体（anti-immuneglobulin M，anti-IgM）刺激来源于野生型小鼠的B细胞，qPCR分析显示：野生型小鼠的B细胞在LPS或者anti-IgM刺激条件下，BAFF能够抑制IL-15的表达。同样地，来源于健康人的B细胞在经过anti-IgM刺激之后，BAFF也能够抑制IL-15的表达。这些结果表明：在不同刺激条件下诱导B细胞，BAFF都能够抑制IL-15的表达。此外，BAFF是通过CD19+B细胞抑制IL-15的分泌，而与CD4+T细胞无关。 4.在BAFF抑制IL-15表达过程中，哪一类脾脏B细胞是关键的，这是需要亟待解决的问题。我们将自身抗原MOG35 55联合BAFF刺激来源于对照组和EAE小鼠的B细胞。通过FACS分析B细胞的不同分群，结果显示：在过渡期2阶段B细胞（Transitional2stage B cells，T2B）中，IL-15呈高表达，而过渡期1阶段B细胞（Transitional1stageB cells，T1B）、边缘区B细胞（marginal zone B cells，MZB）和滤泡B细胞（follicularB cells，FB）中，IL-15呈低表达。在这些细胞类型中，BAFF是通过T2B细胞来抑制IL-15表达的。然而，我们通过FACS和qPCR方法检测经过BAFF治疗的小鼠B细胞中分选T1B、T2B、FB和MZB细胞，结果也显示：IL-15主要表达于T2B细胞，另外，在T2B细细胞转化和T2B细胞向FB细胞转化。这些结果均证明：BAFF能够通过分泌IL-15抑制T2B细胞，从而促进T2B向成熟B细胞转化。 5.调控T2B细胞中IL-15表达的转录因子有哪些？qPCR结果显示：叉头状转录因子O1（forkhead transcription factor1，Foxo1）主要表达于T2B细胞中，这与IL-15的表达是一致的。同时我们使用Foxo1-特定的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）来减少B细胞中Foxo1的表达，然后分选T2B细胞，qPCR分析显示：与Foxo1-未减少的T2B细胞相比，Foxo1-减少的T2B细胞中IL-15呈低表达，而当B细胞中Foxo1过表达时，Foxo1能够上调IL-15mRNA表达和蛋白表达。这些结果表明：在T2B细胞中，Foxo1调节IL-15的表达。 6.为了证明Foxo1直接调节IL-15的表达，我们构建了包含IL-15启动子区域的六个荧光素酶报告基因载体pGL3。通过双荧光素酶报告基因表达分析，我们发现Foxo1限制了IL-15启动子上游1500到1800bp的区域。之后，我们检测了BAFF是否抑制了Foxo1表达。我们使用自身抗原dsDNA或MOG35 55联合BAFF分别刺激来源于狼疮样或EAE小鼠的B细胞，结果发现：BAFF能够明显抑制Foxo1表达。为了进一步证明这些结果，我们使用不同的条件如LPS或anti-IgM来刺激来源于野生型小鼠的B细胞，qPCR分析显示BAFF抑制B细胞中Foxo1表达。同样地，anti-IgM刺激来源于健康人的B细胞，BAFF也同样抑制人B细胞中Foxo1表达。这些结果表明：在不同的刺激条件下，BAFF都能够抑制Foxo1表达。我们也使用蛋白质印迹法（Western blot，WB）方法进行分析，结果显示：在CD19+B细胞中BAFF能够抑制Foxo1表达。另外，我们发现：BAFF诱导Foxo1磷酸化，这表明BAFF通过减少Foxo1磷酸化，从而减少核内Foxo1水平。此外，通过TACI-IgG封闭BAFF能够诱导来源于EAE和狼疮样小鼠B细胞中Foxo1的表达。这些结果共同表明：在B细胞中，BAFF通过下调Foxo1表达，从而抑制IL-15表达。 结论： 1. TACI-IgG是通过有效地减少循环中成熟B细胞数目而发挥作用的，但是记忆B细胞的持续存在和明显上调可能是自身免疫性疾病难以治愈和反复发作的重要原因。 2.在B细胞中，TACI-IgG治疗是通过诱导IL-15从而上调记忆B细胞，而anti IL-15抗体能够有效地减少经过TACI-IgG治疗的狼疮样和EAE小鼠中记忆B细胞的数目，因此，TACI-IgG和anti IL-15抗体可联合用于治疗狼疮样小鼠和EAE小鼠。 3. B细胞中，BAFF通过下调Foxo1表达，从而抑制IL-15表达，所以Foxo1是调控T2B细胞中IL-15表达的重要转录因子。当BAFF促进B细胞成熟时，它能够通过调节Foxo1 IL-15信号途径从而抑制记忆B细胞，这显示Foxo1积极地抑制促进记忆B细胞发育的效应器或终末分化。 4. TACI-IgG联合抗IL-15抗体治疗狼疮样小鼠能够有效减少记忆B细胞数目和降低抗dsDNA抗体的滴度，这对于自身免疫性疾病的治疗是必需的，并为人类自身免疫性疾病的临床应用提供了证据。
[Abstract]:Background :
B cells can not only produce pathogenic antibodies , but also have various effector functions including antigen uptake , transport , antigen presentation to T cells , cytokines and chemokine production , and migration to inflammatory sites , so B cells have become the " culprit " of autoimmune diseases . BAFF is a decisive factor regulating the maturation , survival and function of B cells . In animal models , overexpression of BAFF can lead to the development of autoimmune diseases ;
BAFF has become a new therapeutic target for many autoimmune diseases .
Purpose :
To investigate the mechanism of BAFF in regulating the expression of IL - 15 in B cells , it is proved that the combination therapy of BAFF inhibitor and anti - IL - 15 antibody can be an effective treatment scheme for radically curing autoimmune diseases and reducing the recurrence rate of diseases , and provides a theoretical basis for clinical application .
Methods and Results :
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本文编号：1818066
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