17F对Wistar大鼠成骨细胞增殖、ALP活性和Runx2、Osterix mRNA表达影响

发布时间：2016-11-23 04:39

  本文关键词：糖尿病性骨质疏松发病规律及Runx2、Osterix在骨形成中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

《山东大学》 2015年

IL-17F对Wistar大鼠成骨细胞增殖、ALP活性和Runx2、Osterix mRNA表达影响

赵旭  

【摘要】：目的在不同时间点采用不同浓度的IL-17F干预大鼠原代成骨细胞,观察对大鼠原代成骨细胞的增殖能力和ALP活性的影响,以及对大鼠成骨细胞的转录因子Runx2和Osterix mRNA的表达的影响。探讨IL-17F对大鼠成骨细胞增殖和分化功能的作用,观察成骨细胞特异性转录因子Osterix以及Runx2 mRNA在IL-17F干预下表达的变化,探寻炎症因子IL-17F在骨形成中的作用,以期为临床治疗骨质疏松和相关骨代谢疾病提供理论依据。方法1.细胞提取、培养和鉴定：取出生24小时以内Wistar大鼠8只,雌雄不限,采用拉颈法处死,在无菌条件下取其颅骨,分别采用胰酶-胶原酶消化法和组织块反复贴壁法提取原代成骨细胞,37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内进行细胞培养,待细胞生长至培养瓶底面积80%左右时进行细胞传代,并采用差异贴壁法纯化成骨细胞。采用第4代成骨细胞进行实验。成骨细胞的鉴定：(1)采用倒置相差显微镜观察成骨细胞形态和生长情况,定期拍照记录。(2)采用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)染色法(钙钴法)鉴定成骨细胞。2.实验分组及处理：将第3代成骨细胞,胰酶消化、离心后制成细胞悬液,细胞计数并调整细胞浓度至5×105/ml,加入到6孔板中培养24小时。待细胞贴壁后换用无血清培养基培养24小时,使细胞同步化。将6孔板内细胞随机分为对照组和实验组,对照组采用含10%胎牛血清(Fatal bovine serum, FBS)低糖DMEM培养基培养,前期预实验分别用Ing/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的IL-17F干预成骨细胞,结果显示浓度为20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的IL-17F对成骨细胞的作用明显,因此实验组分别应用含有20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、IL-17F的10% FBS低糖DMEM培养基进行培养。分别在IL-17F干预后的第1、3天留取细胞上清液待测,-80℃保存,成骨细胞进行以下检测。3.指标检测(1)采用CCK-8法检测成骨细胞增殖。(2)采用微量酶标法检测成骨细胞培养上清液中ALP活性。(3)采用RT-PCR法检测成骨细胞转录因子Runx2和Osterix mRNA的表达变化。结果1.成骨细胞的分离、培养和鉴定：胰酶-胶原酶消化法和组织块反复贴壁法均可获取大鼠成骨细胞,其细胞形态特征和生长情况符合成骨细胞特点。通过倒置相差显微镜观察ALP染色结果,发现成骨细胞内的ALP反应生成不溶性染料,呈现黑色颗粒或团块,证明所培养细胞为成骨细胞。2.CCK-8检测细胞增殖：与对照组相比,第1天细胞增殖率实验组50ng/ml组和100ng/ml组均明显升高,差异有统计学意义(P0.05),20ng/ml组也有升高,但差异无统计学意义；第3天实验组20ng/ml、50ng/ml组和100ng/ml组均高于对照组(P0.05)；第5天的实验组20ng/ml组、50ng/ml组和100ng/ml组细胞增殖率增加,差异有统计学意义(P0.05)。与实验组20ng/ml组相比,实验组100ng/ml组在第1、3、5天细胞增值率升高,差异有统计学意义(P0.05)；第3天50ng/ml组和100ng/ml组均高于21ng/ml组,差异有统计学意义(P0.05)。与实验组50ng/ml组相比,100ng/ml组在1、3和5天均明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。3.微量酶标法检测细胞上清液ALP活性与对照组相比,第1天实验组20ng/ml和50ng/ml组ALP活性降低,100ng/ml组ALP活性增加,差异具有统计学意义(P0.05)；第3天实验组20ng/ml和50ng/ml组ALP活性较对照组降低,而100ng/ml组ALP活性与对照组、20ng/ml组和50ng/ml组相比均增加,差异具有统计学意义(P0.05)。4. Runx2和Osterix mRNA表达变化与对照组相比,1、3、5天50 ng/ml组和100ng/ml组Runx2mRNA表达增高(P0.05)：与实验组20ng/ml组相比,第1、3天100ng/ml组Runx2 mRNA表达均增加(P0.05),第5天50ng/ml组和100ng/ml组Runx2mRNA表达均升高(P0.05)；与50 ng/ml组相比,实验组1、3、5天100ng/ml组Runx2mRNA表达均增加,差异具有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,实验组第1、3和5天的50ng/ml组和100ng/ml组Osterix mRNA表达均明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)；第1、3、5天50ng/ml组和100ng/ml组Osterix mRNA表达高于实验组20ng/ml组,差异具有统计学意义(P0.05)；各时间点实验组100ng/ml组Osterix mRNA表达均高于50ng/ml组,差异有统计学意义(P0.05)。结论IL-17F在20ng/ml～100ng/ml浓度范围内可促进成骨细胞的增殖活性,提高ALP活性,这种促进作用很可能与IL-17F上调成骨细胞特异性转录因子Osterix及Runx2mRNA表达有关,浓度为100ng/ml的IL-17F促进作用尤为显著。

【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R580
【目录】：

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本文编号：187450