系统性红斑狼疮P糖蛋白基因多态性及血清糖蛋白糖基化修饰的研究及意义

发布时间：2018-05-13 07:00

本文选题：系统性红斑狼疮 + 糖基化修饰　；参考：《广西医科大学》2015年博士论文

【摘要】：第一部分P糖蛋白基因多态性与广西地区系统性红斑狼疮发病风险相关性研究背景和目的P糖蛋白表达与系统性红斑狼疮发生、发展及治疗等方面有关,MDRl基因是P糖蛋白编码基因,本部分研究P糖蛋白(P-gp)MDRl基因rs1128503和rs1045642单核苷酸多态性(SNP)位点在广西地区系统性红斑狼疮(SLE)患者及健康人群中的基因分布及频率,探讨rs1128503和rs1045642位点基因多态性与系统性红斑狼疮遗传易感性的关系,从基因水平为系统性红斑狼疮的发病机制及靶向治疗等方面研究提供实验基础,发掘与糖蛋白相关的SLE发病风险遗传标记。方法收集来自广西地区的283例SLE确诊患者为病例组,选取251例健康体检者作为对照组。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测MDR1基因rs1128503和rs1045642位点在病例组与对照组的基因分布频率,用DNA测序法测定对应基因序列,以Hardy-Weinberg平衡(HWE)定律检验纳入病例的群体代表性及可比性。SNP等位基因及基因型的分布差异用χ2检验统计,SNP多态性与SLE发病风险的关系用logistic回归方法分析。结果两组在性别和年龄构成上无统计学差异(P0.05),具有可比性。经HWE定律检验,两组基因频率符合遗传平衡,具有群体代表性。rs1128503位点基因型分布频率无统计学差异(P0.05),等位基因分布频率有统计学差异(P0.05)。以对照组为参照,通过logistic回归分析校正性别及年龄因素,计算SLE组与对照组的比值比(OR)值,结果显示：TT较CC基因型(OR=1.77,95%CI=1.08-2.88,P=O.022),T较C等位基因(OR=1.36,95%CI=1.07-1.74,P=0.014),隐性模型(TT vs.CC+C T,OR=1.49,95%CI =1.04-2.14,P=0.029)。通过不同年龄人群分层分析发现,在40岁及以上人群,T较C等位基因(OR=1.41,95%CI=1.01-1.96,P=0.041),TT较CC基因型(OR=1.74,95%CI=1.07-2.79,P=0.021).rs1045642位点基因型及等位基因分布频率无统计学差异(P0.05),SLE发病风险相关性分析无统计学意义(P0.05)。结论P糖蛋白MDR1基因rs1128503位点的T等位基因和纯合子突变TT基因型可能与广西地区人群系统性红斑狼疮的发病风险有正相关关系,尤以40岁及以上人群显著。第二部分系统性红斑狼疮不同活动期血清糖蛋白糖谱差异研究及意义分析背景和目的系统性红斑狼疮是一类与免疫功能密切相关的自身免疫病,免疫反应的异常涉及系统性红斑狼疮发病、进展、疗效及预后。蛋白质糖基化修饰是一种常见的翻译后修饰,在免疫细胞粘附、信号传导、结构稳定、受体构成、细胞分化发育及免疫调控等方面均有重要作用。本部分研究应用凝集素集合芯片技术对系统性红斑狼疮不同活动期患者血清样本进行分析,旨在研究其糖蛋白糖谱特征性变化,筛选系统性红斑狼疮诊断及活动分期相关特征性糖谱标志,为进一步诊疗研究提供思路及基础。方法采用凝集素芯片技术检测血清低丰度蛋白糖链亲和信号,主要包含以下步骤：(1)待测样本预处理：等体积混合4组(健康对照组、活动期初诊组、活动期治疗组及非活动期组)患者血清,使用高丰度蛋白去除柱收集血清低丰度蛋白：(2)收集的低丰度蛋白经除盐、测定浓度后置换为标记缓冲液；(3)待测蛋白用Lightning-Link法进行生物素标记；(4)生物素标记待测蛋白与凝集素芯片进行杂交及Cy5荧光标记；(5)芯片扫描、数据提取；(6)数据统计以SPSS 16.0进行,方差齐者用单因素方差分析,以Student-Newman-Keuls(S-N-K)检验进行两两比较,方差不齐者用秩和检验统计。结果本次研究中,三次重复实验芯片数据变异系数基本满足片内小于15%,片间小于20%。4组样品中共筛选出20种有统计学差异的凝集素阳性亲和信号,分别是AL、HAL、PSA、RCA60、SNA、EEL、LEL、NML VAL、CFL、ConA、JAC、MPL、PCL、PHA-E、MAL-I、HHL、LCA、RCA-I、 STL。其中AAL、HAL、PSA、RCA60及SNA亲和信号在SLE活动期初诊组较健康对照组显著减弱(P0.05),提示SLE活动期初诊组的血清糖蛋白糖链谱中末端岩藻糖、唾液酸化路易斯抗原、N-乙酰半乳糖胺、α连接甘露糖、α.2,6连接唾液酸糖链结构表达减少。而经治疗的活动期治疗组和非活动期组与初诊组相比,上述5种凝集素亲和信号显著上升(P0.05),提示上述相对应的糖链结构合成较初诊组增加,基本恢复到健康对照组水平。EEL、LEL及NML凝集素亲和信号在活动期初诊组较对照组明显增高(P0.05),提示活动期初诊组的血清糖蛋白a1,3连接半乳糖、N-乙酰氨基葡糖、高甘露糖结构显著增多。而活动期治疗组和非活动期组水平与对照组相近,提示经治疗后对应糖链结构表达较初诊组减低,基本恢复到或略低于健康对照组水平。VAL、CFL及MPL信号在初诊组与对照组无显著差异,在治疗组和非活动期组显著增高(P0.05)。ConA、JAC、PCL及PHA-E的信号在初诊组较对照组显著升高,在经治疗后的两组,上述4种凝集素信号进一步提高(P0.05)。其余5种凝集素STL、MAL-I、HHL、LCA、 RCA-I亲和信号在4个实验组中也有相应特征性变化。结论各种凝集素亲和信号变化趋势各有不同,表示SLE治疗过程中不同活动期血清糖蛋白糖链结构变化的复杂性与特异性,这提示以SLE不同活动期血清特征性糖谱作为疾病活动度分期生物标志具备一定的实验基础。SLE初诊期血清糖蛋白结构中末端岩藻糖、唾液酸化路易斯抗原、N-乙酰半乳糖胺、α连接甘露糖及α2,6连接唾液酸结构合成明显减少,α1,3连接半乳糖、N-乙酰氨基葡糖、高甘露糖结构合成增多,而经治疗后,这些糖链结构的合成逐渐恢复至接近正常水平。提示这些糖链结构表达水平变化可能与SLE发病机制或疾病活动进展有关。第三部分系统性红斑狼疮不同活动期血清糖蛋白糖谱差异免疫验证背景和目的凝集素作为糖的“解码器”在糖组学和糖蛋白组学研究中应用广泛。但与抗原抗体反应相比,凝集素与糖链结构结合的亲和性和特异性仍是其相关技术的“瓶颈”。因此,对凝集素芯片的结果,常需要使用其它实验方法进行验证,以提高实验数据的准确性和可重复性。在本部分研究中,我们以凝集素芯片检测同批血清样本及按相同纳入标准收集的另批次血清样本为研究对象,采取凝集素免疫印迹技术对凝集素芯片结果进行重复验证,以提高芯片结果的可靠性。方法选取凝集素芯片检测同批混合血清样本及按相同纳入标准收集的另批次血清样本为研究对象,实验步骤主要包括：(1)制备混合血清样本与富集血清低丰度蛋白,测定蛋白浓度后备用;(2)待测蛋白进行SDS-PAGE电泳后,用半干转膜法将蛋白转至PVDF膜；(3)PVDF膜与生物素标记凝集素杂交后,进行辣根过氧化物酶标记：(4)利用增强化学发光法检测标记凝集素蛋白条带；(5)结果扫描及Quantity One软件分析。结果以凝集素芯片检测同批混合血清及另批次血清进行凝集素免疫印迹验证,选择SNA、ConA、PHA-E、LCA、PSA及AAL 6种凝集素进行,膜条结果用Bio-rad公司的Quantity One软件进行分析,以蛋白条带灰度值总和代表条带的强度,即相应糖链结构的水平。验证结果以条带灰度柱形图表示,结果显示：同批混合血清凝集素验证结果变化趋势基本与凝集素芯片结果一致；另批次血清凝集素验证结果变化趋势大部分与芯片结果相符,PHA-E验证结果中非活动期组蛋白条带灰度较弱,与初诊组相近,这与芯片结果比较有偏差。两批次验证条带整体强度与芯片荧光强度结果有所差异。结论两批次血清样本凝集素免疫印迹验证结果大部分与凝集素芯片结果相一致,可以基本证实本次研究凝集素芯片结果的准确性和可重复性。新批次验证结果中PHA-E凝集素组的不一致性可能与个体差异、批间误差等因素有关。具体仍有待进一步研究。两批次验证结果都存在印迹条带强度与芯片荧光强度不完全一致的现象,原因可能由验证凝集素的稀释度不同或方法学差异所致。第四部分静注唾液酸化免疫球蛋白与系统性红斑狼疮治疗有效性的循证医学研究背景和目的静注免疫球蛋白近年来逐渐用以治疗系统性红斑狼疮,其机制与IgG分子连接的糖链结构α2,6唾液酸有关。但是,静注免疫球蛋白对系统性红斑狼疮疗效的影响在已发表文献中报道并非完全一致。因此,我们以临床随机研究为对象,采用循证医学研究方法探讨糖皮质激素和免疫抑制剂联合静脉注射唾液酸化免疫球蛋白治疗系统性红斑狼疮的效果。方法通过计算机检索PubMed.EMBASE.Cochrane图书馆等外文数据库以及中国知网、中国生物医学文献、万方、维普等中文数据库,查找糖皮质激素和免疫抑制剂联合静注唾液酸化免疫球蛋白治疗系统性红斑狼疮的随机对照试验(文献发表于2015年2月10日之前),对入选研究进行筛选、资料提取,临床缓解率、系统性红斑狼疮疾病活动指数、补体C3血清学变化、24小时蛋白尿、院内感染率等具体指标直接或间接由最终纳入文献提取或计算,并对文献质量按Jadad量表进行评价,提取数据使用Stata12.0统计软件进行荟萃分析。结果检索及筛选后共纳入5个随机对照试验研究,共237例患者,其中试验组115例,对照组122例。荟萃分析结果显示：糖皮质激素和免疫抑制剂联合静注唾液酸化免疫球蛋白组与对照组相比,提高SLE患者临床缓解率(OR=2.99,95%CI=1.53-5.85,P=0.001)和降低院内感染率(OR=0.26,95%CI=0.10-0.66,P=0.005)差异有统计学意义。但对降低狼疮活动指数SLEDAI评分(WMD=-1.80,95%CI=-3.96-0.35,P=0.101)和24小时尿蛋白量(WMD=-1.09,95%CI=-2.20-0.03,P=0.056)差异无统计学意义。结论目前基于临床随机研究的循证医学证据表明,静注射唾液酸化免疫球蛋白与激素、免疫抑制剂联合治疗系统性红斑狼疮,对提高临床缓解率和降低院内感染发生率方面有积极作用,而对SLE活动指数及24小时尿蛋白量的影响无统计学差异。这一相关性有待更多的临床研究证实,而免疫球蛋白唾液酸糖基化修饰对提高系统性红斑狼疮治疗有效性的具体机制也有待进一步探索。
[Abstract]:The gene distribution and frequency of rs1128503 and rs1045642 loci in SLE patients and healthy population were analyzed by using PCR - RFLP . It was found that T allele and homozygous mutation TT genotype of P glycoprotein MDR1 gene rs1128503 could be positively correlated with the risk of systemic lupus erythematosus in Guangxi .
( 3 ) the protein to be detected is labeled with a Lightning - Link method ;
( 4 ) biotin labeling the protein to be detected and a lectin chip for hybridization and Cy5 fluorescence labeling ;
( 5 ) chip scanning and data extraction ;
The results showed that there were no significant differences between the two groups in the early diagnosis group than those in the control group ( P0.05 ) . The results showed that the levels of serum glycosilation , sialylated Lewis antigen , N - acetylgalactosamine , 伪 - linked mannose , 伪 . 2,6 - linked sialic acid in the early diagnosis group were significantly higher than those in the control group .
( 3 ) after the PVDF membrane is hybridized with the biotin - labeled lectin , carrying out horseradish peroxidase marking : ( 4 ) detecting the labeled lectin protein band by using the enhanced chemiluminescence method ;
( 5 ) Result scanning and Quantity One software analysis . The results were as follows : lectin chip was used to detect the lectin immunoblot verification in the same batch of mixed serum and another lot of serum . The results were analyzed by using the Quantity One software of Bio - rad . The results show that the results show that the change trend of the results is consistent with the results of lectin chip .
The results of this study are as follows : The results of this study are as follows : The results of this study are as follows : The results of this study are as follows : The results of this study are as follows : The results of this study are consistent with the results of the results .

【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.241

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