miRNA在初发Graves病调节性T细胞中差异表达及荧光标记miRNA与细胞非特异结合的研究

发布时间：2018-05-17 00:12

  本文选题：Graves病 + 调节性T细胞　； 参考：《山东大学》2016年硕士论文

【摘要】：研究背景miRNA是一种长约22nt的非编码小RNA分子,在几乎所有生命活动和疾病的发生发展中都发挥关键作用。Graves病(GD)是一种最常见的自身免疫性疾病,而调节性T细胞(Treg)是免疫调控中的关键细胞。已有研究表明microRNA对自身免疫性疾病的发生发展有提示作用,但是microRNA在Graves病中的研究还很少,在Graves病患者外周血Treg细胞中的研究更少。另外,在研究microRNA的众多方法中,荧光标记和脂质体转染是最常用的两种方法.这两种方法结合可以方便的改变细胞miRNA水平,并示踪定位miRNA在细胞内的位置,在miRNA的研究中发挥重要作用。然而,尽管已有大量脂质体转染核酸机制的研究,但迄今为止对荧光素标记的miRNA分子在脂质体转染过程中的特点、机制和特异性的研究仍然不多。研究目的研究microRNA在初发Graves病Treg中的差异表达情况及作用,并探讨microRNA在外周血Treg中研究较少的原因,以及针对其中荧光标记的microRNA非特异性粘附在细胞膜表面的现象进行深入研究。研究材料和方法我们收集45例初发Graves病患者和61例正常人外周血,用流式细胞仪分离出CD4+CD25highTreg细胞,比较Treg细胞比例和数目变化情况；再利用实时荧光定量(RT-PCR)方法从CD4+CD25highTreg细胞中筛选出表达有差异的microRNA;最后从差异表达的microRNAs中选出一个研究其在正常Treg中的功能。另外,对于在研究过程中发现的Cy5荧光标记的microRNA在转染过程中与细胞的非特异性结合这一现象,进一步利用不同荧光素(亲水性的羧基荧光素FAM和疏水性的碳烯花菁类Cy5)标记的不同microRNA用脂质体转染不同细胞(悬浮细胞K562和贴壁细胞Hela),并用流式细胞仪和共聚焦显微镜等技术深入研究了在脂质体转染中这种荧光标记miRNA与细胞之间非特异性粘附的普遍性及其可能机制。研究结果初发Graves病患者外周血CD4+CD25highTreg细胞占CD4+T细胞的比例和数目与正常人相比,没有明显差异。而且,单位体积外周血中CD4+CD25highTreg细胞含量很少。但是,PCR发现,与正常组相比,miR28、miR363和miRl91在初发Graves病患者外周血CD4+CD25highTreg中表达有差异,miR28和miR363高表达,miR191低表达。一些在CD4+CD25highTreg中含量很低的microRNA如miR190、miR519e、miR374a等检测不出。流式细胞仪和共聚焦显微镜检测显示Cy5荧光标记的microRNA在利用脂质体转染CD4+T细胞过程中存在非常明显的非特异性粘附。非特异性粘附研究结果表明,在未加入脂质体转染试剂的情况下,碳烯花菁类荧光染料Cy5标记的miRNA分子能与贴壁的Hela细胞和悬浮的K562细胞表面牢固结合；而羧基荧光染料FAM与K562细胞表面的结合也非常明显,但与Hela细胞表面的结合不明显。加入转染试剂后,由于贴壁细胞转染效率较高,与细胞表面结合的大部分荧光标记miRNA分子都进入贴壁的Hela细胞内；而绝大部分荧光标记miRNA分子仍与悬浮的K562细胞表面结合,未进入细胞。而且,破坏静电相互作用的高盐buffer不影响上述荧光标记miRNA分子与不同细胞表面的非特异结合,但破坏疏水相互作用的有机溶剂可以消除它。这提示荧光标记的miRNA可能是通过疏水相互作用而与细胞表面非特异结合。研究结论这些结果提示,初发Graves病患者外周血CD4+CD25highTreg比例和数目没有变化,但是Treg中存在部分microRNA差异表达现象,这些microRNA可能与Graves病患者体内免疫失调有关。但是,外周血Treg细胞含量少,而且由于其本身原代悬浮的特性,使microRNA在Treg细胞中的功能研究受到技术限制。其中作为研究microRNA在细胞内到底发挥何种作用时常用的荧光标记microRNA转染细胞的技术存在荧光染料与细胞膜之间发生非特异性粘附。非特异性粘附机制研究结果表明,转染碳烯花菁类荧光染料标记的miRNA分子,特别是转染这些分子到悬浮细胞时,仅根据细胞荧光强度评估转染效率会导致明显的误差。应当选择其它荧光染料或其它方法评价转染效率。而且,也需要根据研究所用的细胞类型选择更适当的荧光染料,并设置严格的对照组,以保证结果的准确性。
[Abstract]:The research background miRNA is a non - coding small RNA molecule with a length of about 22nt , plays a key role in the development of almost all living activities and diseases . Graves disease ( GD ) is the most common autoimmune disease , and the regulatory T cell ( Treg ) plays an important role in the development of autoimmune diseases .
The expression of CD4 + CD25highTreg cells in peripheral blood of Graves disease was detected by flow cytometry and confocal microscopy .
However , the binding of the carboxy fluorochrome to the surface of K562 cells is very obvious , but the binding of the surface of Hela cells is not obvious . After the transfection reagent is added , most of the fluorescent labeled miRNA molecules bound to the cell surface enter the Hela cells of the adherent cells due to the high transfection efficiency of the adherent cells ;
It is suggested that the fluorescent labeled miRNA may be a non - specific binding to the cell surface by hydrophobic interaction . The results suggest that the fluorescent labeled miRNA may be related to the immune disorder in the cell surface by hydrophobic interaction . The results suggest that the fluorescent label miRNA may be a non - specific adhesion to the cell surface by hydrophobic interaction .
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R581

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本文编号：1899025