高糖调节巨噬细胞中骨桥蛋白表达的作用机制研究

发布时间：2018-05-28 09:18

  本文选题：骨桥蛋白 + 糖尿病　； 参考：《第二军医大学》2017年硕士论文

【摘要】：糖尿病患者血糖升高是促进其血管并发症发生发展的重要因素,而血管并发症是糖尿病患者致残、致死的主要原因。骨桥蛋白(OPN)是血管并发症中动脉粥样斑块形成的重要因素,在糖尿病患者血浆和动脉斑块中表达增加,高血糖可促进平滑肌细胞和内皮细胞中OPN的表达,但其表达调控机制尚不清楚。FoxO1是叉头框转录因子家族Fox O亚家族的一员,被认为与糖尿病胰岛素抵抗密切相关。在本课题中,我们选取小鼠巨噬细胞RAW 264.7为细胞模型,通过高糖培养基刺激培养和过表达FoxO1,检测OPN的mRNA和蛋白表达水平,及培养上清中的OPN浓度,Western blot检测FoxO1的磷酸化水平。通过构建3组FoxO1特异性的shRNA表达载体,进一步检测FoxO1的表达抑制对OPN表达的作用。克隆和构建了小鼠OPN的启动子区荧光素酶报告基因载体,分别通过高糖刺激和Fox O1的shRNA干扰,检测其启动子区的活性变化。通过EMSA实验和Ch IP实验进一步确定Fox O1与OPN启动子区的结合情况。通过本课题的研究,我们发现高糖可诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7中OPN的表达上调及抑制FoxO1的磷酸化;通过过表达FoxO1,发现野生型和激活型FoxO1可促进OPN的表达,而失活型FoxO1减弱OPN的表达;通过shRNA介导的Fox O1表达下调,OPN的表达水平随之下调。为进一步明确其机制,我们克隆获得了小鼠的OPN启动子区序列,发现其活性主要集中于-1918~-713区段,其中包含10个FBE位点;而-713~+79区段不包含FBE位点,活性很低。同时高糖刺激和shRNA干扰实验进一步证实,高糖可激活-1918~-713区段的转录活性,而FoxO1被干扰后可抑制该区段的活性。EMSA实验和ChIP实验进一步证实了FoxO1可与OPN启动子区结合。我们的研究结果为糖尿病血管并发症的发病机制提供了一条新的线索,并有望作为临床上一种潜在的血管病变风险评价指标。
[Abstract]:Hyperglycemia is an important factor to promote the occurrence and development of diabetic vascular complications, and vascular complications are the main cause of disability and death in diabetic patients. Osteopontin (OPN) is an important factor in atherosclerotic plaque formation in vascular complications. The expression of osteopontin in plasma and atherosclerotic plaques is increased in diabetic patients. Hyperglycemia can promote the expression of OPN in smooth muscle cells and endothelial cells. However, the mechanism of its expression regulation is not clear. FoxO1 is a member of the Fox O subfamily of the fork frame transcription factor family, which is considered to be closely related to insulin resistance in diabetes mellitus. In this study, we selected mouse macrophage RAW 264.7 as cell model, stimulated and overexpressed FoxO1 in high glucose medium, detected the expression of mRNA and protein in OPN, and detected the phosphorylation level of FoxO1 in the culture supernatant by Western blot. Three groups of FoxO1 specific shRNA expression vectors were constructed to detect the effect of FoxO1 expression inhibition on OPN expression. The luciferase reporter gene vector of mouse OPN promoter region was cloned and constructed. The activity of the promoter region was detected by high glucose stimulation and shRNA interference of Fox O1, respectively. The binding of Fox O 1 to OPN promoter region was further determined by EMSA and Ch IP experiments. In this study, we found that high glucose could induce the up-regulation of OPN expression and inhibit the phosphorylation of FoxO1 in mouse macrophage RAW 264.7, and by overexpressing FoxO1, we found that wild type and activated type FoxO1 could promote the expression of OPN. But inactivated FoxO1 attenuated the expression of OPN, and the expression of Fox O1 was down-regulated by shRNA mediated expression of Fox O1. In order to further clarify its mechanism, we cloned the mouse OPN promoter sequence and found that its activity was mainly concentrated in the -1918 ~ 713 region, which contained 10 FBE loci, while the -713 ~ 79 region did not contain the FBE site, and its activity was very low. At the same time, hyperglycemic stimulation and shRNA interference experiments further confirmed that high glucose could activate the transcriptional activity of the -1918C-713 region, while FoxO1 could inhibit the activity of this region. EMSA and ChIP experiments further confirmed that FoxO1 could bind to OPN promoter region. Our results provide a new clue for the pathogenesis of diabetic vascular complications and may be used as a potential risk indicator for vascular diseases.
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2

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本文编号：1946149