Caveolin-3基因P47L和P104L突变对骨骼肌细胞糖代谢的影响及其机制研究
本文选题：Caveolin-3 + 突变 ； 参考：《广西医科大学》2016年硕士论文
【摘要】：目的Caveolin-3(CAV3,微囊蛋白3)蛋白是一种肌细胞特异蛋白,在调节胰岛素信号通路、葡萄糖代谢以及维持肌肉生理结构和功能发挥重要作用。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的发病具有明显的遗传背景,我们前期发现T2DM病人存在CAV3基因的外显子突变。CAV3基因突变还与多种肌组织病变有关,其中一种人类常染色体显性遗传的肢带型肌营养不良(limb girdle muscular dystrophy-1C, LGMD-1C)是由于CAV3基因的编码区P104L突变导致,肌无力为主要临床表现。T2DM和LGMD-1C的发病是否由于CAV3突变导致骨骼肌细胞糖代谢障碍、糖利用下降和供能不足尚未清楚。本实验旨在从细胞水平研究T2DM的CAV3基因P47L突变和LGMD-1C的CAV3基因P104L突变对骨骼肌细胞胰岛素信号通路及其糖代谢的影响,探讨T2DM及LGMD-1C的发病机制。方法我们利用生物信息学分析LGMD-1C的P104L突变以及T2DM病人CAV3基因编码区的3个错义突变：K14N、D15H和P47L,选P47L和P104L突变点在野生型CAV3的基础上构建表达载体,用脂质体转染试剂盒Lipofectamine3000转染入C2C12成肌细胞中。建立4组表达不同基因型的细胞株：转染对照空载体的阴性对照(NC)组、转染野生型CAV3基因的野生型(WT)组、转染P47L突变组和转染P104L的突变组。用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)和糖原测定试剂盒分别检测100nM胰岛素刺激后4组分化的C2C12细胞的葡萄糖消耗和糖原合成,Western blot检测胰岛素介导的糖代谢相关信号分子的蛋白表达量,免疫共聚焦观察CAV3和GLUT4的细胞定位和表达。结果(1)通过生物信息学综合分析,K14N、D15H和P47L突变使蛋白质的二级结构都发生了改变,并且P47L突变位于Caveolin (CAV)家族的保守序列区,P104L位于CAV3蛋白的穿膜区。(2)与WT组相比,P47L和P104L突变组中的C2C12成肌细胞胰岛素刺激后葡萄糖的消耗和糖原合成减少(P0.05)；与NC组比较,过表达野生型CAV3增加葡萄糖的消耗(P0.05)和糖原合成。(3) Western blot结果显示,与WT组相比,P47L和P104L突变组中CAV3、CAV1和磷酸化的Akt(pAkt)蛋白表达降低；4组细胞总蛋白GLUT4和Akt表达无明显差异。免疫共聚焦可以看出,与WT组相比,P47L组细胞膜上CAV3和GLUT4表达减少；与NC组相比,WT组细胞膜上GLUT4表达明显增多。而P104L突变使CAV3和GLUT4聚集在核旁,胞膜上表达缺失。结论CAV3基因P47L和P104L突变都导致C2C12细胞葡萄糖摄取和糖原合成减少,其原因可能是突变通过减少膜上CAV3的表达,抑制胰岛素信号的Akt通路,导致GLUT4移位到胞膜受阻,从而减少葡萄糖摄取和糖原合成。此外,这两个突变都导致CAV家族的另一个亚型CAV1减少,而CAV1在骨骼肌细胞胰岛素依赖的葡萄糖摄取中起到重要作用。骨骼肌细胞葡萄糖利用障碍和葡萄糖供能不足可能参与T2DM和LGMD-1C的发病机制。
[Abstract]:Objective Caveolin - 3 ( CAV3 ) protein was a kind of muscle cell specific protein , which plays an important role in regulating insulin signaling pathway , glucose metabolism and maintaining the physiological structure and function of muscle .
Compared with NC group , overexpression of wild type CAV3 increased glucose consumption ( P0.05 ) and glycogen synthesis . ( 3 ) Western blot analysis showed that the expression of CAV3 , CAV1 and phosphorylation in P47L and P104L groups decreased compared with WT group .
Compared with WT group , the expression of CAV3 and GLUT4 in P47L group was decreased compared with WT group .
Conclusion CAV3 gene P47L and P104L can decrease the glucose uptake and glycogen synthesis of C2C12 cells . Conclusion CAV3 gene P47L and P104L can decrease the glucose uptake and glycogen synthesis of C2C12 cells .
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2
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，本文编号：1989893
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