环境污染物多氯联苯、全氟辛烷磺酸激活胰岛β细胞NLRP3炎症小体信号及机制研究

发布时间：2018-06-07 21:18

本文选题：糖尿病 + 持久性有机污染物　；参考：《西南医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:糖尿病为第二大慢性非传染疾病,糖尿病及其急慢性并发症严重地影响着糖尿病患者的生活质量及寿命,但目前糖尿病的发病机制尚不明确,研究表明糖尿病为遗传因素和环境因素之间复杂的相互作用所导致。越来越多的证据表明,环境污染与糖尿病发病关系密切。持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants,POPs)中的多氯联苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs)、全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulphonate,PFOS)具有生物蓄积性、持久性、高毒性及远距离迁移性等特点,研究发现全球范围内能在人体、动物、环境中检测到它们的存在,且与多种疾病比如糖尿病、甲状腺疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等的发生发展有着密切关系,但持久性有机污染物中的PCBs、PFOS能否导致糖尿病的发生及具体机制目前仍不明了。糖尿病发生的中心环节是长期低度炎症反应的发生,且固有免疫介导的炎症反应为重要环节,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(即NLRP3)为固有免疫反应中的一员,被细胞内外的危险信号分子通过多种途径激活,比如活性氧(ROS)的产生等,进而活化半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase-1)信号途径,促进炎症因子的产生。有研究发现能在糖尿病患者体内检测到高浓度的环境污染物,比如PCBs、PFOS、二VA英、双酚A等,且也能检测到高浓度的炎症因子,但PCB118、PFOS能否通过ROS机制激活胰岛β细胞NLRP3炎症小体导致胰岛β细胞炎症反应,进而参与糖尿病的发生目前尚不清楚。本研究旨在探讨持久性有机污染物中的多氯联苯118(pcb118)、全氟辛烷磺酸(pfos)对小鼠胰岛β-tc-6细胞中ros、nlrp3炎症小体信号分子、炎症因子表达的影响及相关机制。方法:1、实验对象及处理因素:实验对象为小鼠胰岛β-tc-6细胞,体外培养该细胞,干预因子为不同浓度的pcb118、pfos,抑制剂为活性氧抑制剂n-乙酰半胱氨酸(nac)。2、细胞毒性实验:使用不同浓度的pcb118(5nmol/l、10nmol/l、20nmol/l、40nmol/l、80nmol/l、160nmol/l、320nmol/l)、pfos(1nmol/l、10nmol/l、100nmol/l、1000nmol/l、10000nmol/l)分别干预小鼠胰岛β-tc-6细胞48h及72h,使用cellcountingkit-8(cck-8试剂盒)分别检测pcb118、pfos对该细胞的毒性作用。3、实验分组:pcb118干预时,将小鼠胰岛β-tc-6细胞分为二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,dmso)溶剂对照组、不同浓度pcb118组(5nmol/l、10nmol/l、20nmol/l)及pcb118+nac组(于表达变化最强的浓度组中预先加入10umol/l的活性氧抑制剂nac抑制活性氧的产生,了解ros在pcb118激活小鼠胰岛β-tc-6细胞中nlrp3炎症小体的作用);pfos干预时,将小鼠胰岛β-tc-6细胞分为甲醇溶剂对照组、不同浓度pfos组(1nmol/l、10nmol/l、100nmol/l)及pfos+nac组(于表达变化最强的浓度组中预先加入10umol/l的活性氧抑制剂nac抑制活性氧的产生,了解ros在pfos激活小鼠胰岛β-tc-6细胞中nlrp3炎症小体的作用)。4、检测方法:⑴各组小鼠胰岛β-tc-6细胞培养至适当时机随机加入不同的作用物培养48h及72h,使用cck-8试剂盒检测不同浓度pcb118、pfos对小鼠胰岛β-tc-6细胞的毒性作用。⑵各组小鼠胰岛β-tc-6细胞培养至适当时机随机加入不同的干预物培养48h:(1)装载2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐探针(2',7'-dichlorofluorescindiacetate,dcfh-da),用全光谱分光光度计检测各组细胞内ros的表达水平。(2)采用蛋白免疫印迹(western-blot)法检测各组nlrp3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-il-1β、il-1β蛋白的表达。(3)取细胞培养液离心后采用elisa法检测il-6、il-18、c-c趋化因子配体2(ccl-2)炎症因子的表达水平。5、统计学分析:采用统计分析软件spss17.0进行数据统计学分析,数据采用均数±标准差(xˉ±s)表示,各组内比较采用的是方差齐性检验,各组间比较采用的是单因素方差分析,各组间的多重比较采用的是lsd-t方法,检验标准为α=0.05,p0.05表示差异有统计学意义。结果:1.细胞毒性实验显示,pcb118干预细胞48h时,各浓度对细胞没有明显的毒性,各浓度间差异无统计学意义(p0.05);干预72h,浓度大于等于80nmol/l时,对细胞有明显毒性,差异有统计学意义(p0.05);pfos干预细胞48h、72h,浓度为10000nmol/l时,对细胞有明显毒性,差异均具有统计学意义(p0.05)。2.不同浓度的pcb118、pfos对小鼠胰岛β细胞内的ros、nlrp3炎症小体信号分子表达的影响:与溶剂对照组相比,pcb118、pfos均可上调ros及nlrp3、caspase-1、il-1β蛋白的表达(p0.05),下调pro-caspase-1、pro-il-1β蛋白的表达(p0.05),且呈浓度依赖性。与高浓度的pcb118、pfos组相比,nac预处理可阻止pcb118、pfos诱导的ros及nlrp3、caspase-1、il-1β蛋白表达的上调(p0.05)和pro-caspase-1、pro-il-1β蛋白表达的下调(p0.05)。3.与溶剂对照组相比,pcb118、pfos均可上调il-6、il-18、ccl-2炎症因子的表达(p0.05),nac预处理可阻止pcb118、pfos诱导的il-6、il-18、ccl-2炎症因子表达的上调(p0.05)。结论:多氯联苯118、全氟辛烷磺酸可通过活性氧机制激活胰岛β细胞NLRP3炎症小体、参与胰岛β细胞炎症反应的发生。
[Abstract]:Objective : Diabetes mellitus is the second major chronic non - infectious disease , and diabetes mellitus and its acute and chronic complications seriously affect the quality of life and life of diabetic patients . The effects of different concentrations of pcb118 ( 5 nmol / l , 10 nmol / l , 20 nmol / l , 10 nmol / l , 80 nmol / l , 100 nmol / l , 10 nmol / l ) , pfos ( 1 nmol / l , 10 nmol / l ) , pfos ( 1 nmol / l , 10 nmol / l ) , pfos ( 1 nmol / l , 10 nmol / l ) , pfos ( 1 nmol / l , 10 nmol / l ) , pfos ( 1 nmol / l , 10 nmol / l ) , pfos ( 1 nmol / l , 10 nmol / l , 100 nmol / l , 1000 nmol / l , 10000 nmol / l ) on pancreatic 尾 - tc - 6 cells in mice were investigated . ( 1 ) 2 ' , 7 ' - dichlorofluorescein diacetate ( dcfh - da ) was loaded . The expression level of ros in each group was measured by a full spectrum spectrophotometer . ( 2 ) The expression of each group of nlrp3 , pro - caspase - 1 , caspase - 1 , pro - il - 1尾 , il - 1尾 protein was detected by Western - blot . ( 3 ) The expression of IL - 6 , il - 18 , c - c chemokine ligand 2 ( ccl - 2 ) inflammatory factor was detected by enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) . The expression of ccl - 2 inflammatory factor ( p0.05 ) can prevent the up - regulation of the expression of il - 6 , il - 18 , ccl - 2 inflammatory factors induced by pcb118 and pfos ( p . 05 ) . Conclusion : Polychlorinated biphenyl 118 , perfluorooctane sulfonate can activate the inflammatory small body of pancreatic 尾 - cell NLRP3 by active oxygen mechanism and participate in the inflammatory reaction of 尾 - cell of pancreatic island .
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.1

【参考文献】