葡萄糖氧化致血管收缩及其线粒体机制

发布时间：2018-06-27 16:20

  本文选题：线粒体膜电位 + 平滑肌　； 参考：《第四军医大学》2017年博士论文

【摘要】：研究背景在糖尿病等代谢紊乱疾病中血管并发症高发,这与血管的收缩和舒张功能受损有关。代谢紊乱的长期刺激(高糖、高胰岛素)首先损伤内皮细胞,而后影响血管功能。同时,控制饮食、减少体重、增加锻炼等方式可以有效改善血管功能。这说明代谢与血管功能密切相关。在生理条件下,代谢会对血管收缩舒张功能产生何种作用?在糖尿病等病理条件下,其作用是否会发生改变?代谢紊乱又与高血压的产生有何种联系?葡萄糖是血管维持收缩的主要能量来源。与其它组织不同,血管中葡萄糖代谢的主要方式是无氧酵解,但越来越多的证据表明线粒体参与调节血管的收缩作用。比如,血管平滑肌细胞的线粒体分裂增加引起血管收缩。那么线粒体在葡萄糖代谢引起的血管功能改变中会起到何种作用?在糖尿病中,上述作用又会出现何种改变?这都是吸引我们进行本课题的原因。研究目的本研究旨在明确血管组织自身葡萄糖代谢是否影响血管收缩舒张功能。若是,进一步探究其主要作用机制及意义。实验方法及结果1.本实验招募8名健康成年男性,年龄20-30岁之间,观察在糖耐量实验过程中,血压、肱动脉血管口径、心排出量的变化。发现口服葡萄糖(1.0 g/kg)后30 min,血糖和肱动脉血压明显增高,超声检测显示肱动脉血管口径显著减少,但每搏输出量、心率和心输出量并未发生明显改变。服糖后90 min,血糖、血压和血管口径恢复正常。相关性分析发现血糖分别与血压(P=0.02)和血管口径(P=0.03)有较好的相关性。上述结果提示葡萄糖引起的血压增高可能与血管收缩有关。2.为观察葡萄糖对血管的直接作用,我们分离了小鼠的胸主动脉。发现葡萄糖(30 mM)可以诱导血管收缩。甘露醇的对照实验显示,上述现象并非由渗透压引起。然而血管在生理及大多数病理环境中并不存在30 mM葡萄糖,在体环境中伴随葡萄糖升高会有胰岛素的增加,因此我们又采用了葡萄糖和胰岛素的混合液(glucose10 mM和insulin 10 nM,G+I)。血管张力结果显示,G+I可以诱发与30 mM葡萄糖相同的血管收缩幅度。有趣的是,与30 mM葡萄糖引起的血管持续收缩不同,G+I引起的血管收缩是短时性的,这与在体葡萄糖引起的血管收缩时程类似,说明离体中G+I可以更好地模拟葡萄糖的在体刺激。3.为明确是内皮还是平滑肌在其中起主要作用,我们进一步采用机械法去除血管内皮细胞,发现有无内皮并不影响30 mM葡萄糖或G+I所致的血管收缩作用。说明平滑肌而非内皮细胞介导了葡萄糖引起的血管收缩。进一步我们分离原代小鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs),检测调节平滑肌细胞收缩的关键蛋白--肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)的磷酸化水平。发现30 mM葡萄糖或G+I都可以引起MLC的磷酸化水平增加,而给予α-CCA(线粒体丙酮酸转运体抑制剂)抑制丙酮酸进入线粒体后,上述作用消失。这说明平滑肌细胞线粒体参与的葡萄糖氧化介导了血管收缩。4.线粒体是葡萄糖代谢的中心环节,其产生ATP以维持平滑肌细胞收缩。在血管平滑肌细胞中,30 mM葡萄糖或G+I都可以增加线粒体的耗氧量及电子供体NADH和FADH2,并且G+I的增加幅度更高,因此之后的实验采用G+I作为增加葡萄糖氧化的方法。为明确线粒体如何介导血管收缩,我们采用了FCCP(H+载体),Valinomycin(K+载体),Nigericin(H+/K+交换体)和Monesin(H+/Na+交换体),分别干预线粒体膜电位(△Ψm)、质子梯度、ATP、K+和Na+等,观察线粒体的何种组分参与血管收缩,最终发现△Ψm的变化与血管的收缩舒张趋势一致。而后,用NH4Cl直接增加△Ψm可引起血管收缩;用CH3COONa直接降低△Ψm可导致血管舒张。同时我们发现,G+I可以增加原代平滑肌细胞的△Ψm以及离体血管平滑肌的△Ψm,而FCCP(降低△Ψm)或Nigericin(维持△Ψm相对恒定)预处理后,G+I对平滑肌细胞△Ψm的增加作用消失,并且G+I对血管的收缩能力也显著下降。上述结果说明葡萄糖氧化通过增加平滑肌△Ψm引起血管收缩。5.那么葡萄糖氧化增高△Ψm是如何进一步调节血管收缩的呢?我们关注到MLC的调节因素上。目前主要有两条通路介导MLC的磷酸化:Ca2+依赖的肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinases,MLCK)和Ca2+非依赖的Rho蛋白激酶(Rho kinase,ROCK)。干扰Ca2+的作用(BAPTA-AM,TG预处理)后,G+I的血管收缩作用依旧存在,而阻断ROCK(Y27632,Fasudil预处理)可以抑制G+I的血管收缩作用,说明ROCK通路在其中起主要作用。ROCK蛋白的上游调节因子主要是Rho蛋白家族,我们发现G+I并未改变胞浆中的RhoA的活性,却增加了线粒体上的Rho蛋白miro(mitochondrial Rho)的活性。为进一步探究miro在血管收缩调节中的作用,我们给予miro-siRNA下调miro表达后,G+I诱导的MLC磷酸化水平下降;给予miro-adenovirus上调miro表达后,G+I诱导的MLC的磷酸化水平增加。另外,增加△Ψm时,miro的活性增加;而降低△Ψm时,miro的活性下降。上述结果说明葡萄糖氧化引起的血管收缩主要通过△Ψm-miro介导的ROCK-MLC通路激活引起。6.在明确葡萄糖氧化引起血管收缩后,我们进一步探讨上述机制是否介导糖尿病血管功能障碍。采用STZ和高脂饮食诱导的糖尿病大鼠进行糖耐量实验(2.0 g/kg,腹腔注射)。发现给予葡萄糖后90 min血糖、胰岛素、尾动脉血压仍维持在较高水平,同时伴随着腹主动脉出现持续收缩。分离db/db小鼠的胸主动脉进行离体实验,发现G+I引起db/db小鼠血管收缩的时间延长(P=0.03)。并且离体血管△Ψm的变化与血管张力的变化有相似的趋势:G+I处理后,对照小鼠出现短时的△Ψm增高,而db/db小鼠△Ψm增高的时间显著延长。进一步发现,G+I刺激后30 min时db/db小鼠ROCK的下游MYPT-1和MLC的磷酸化仍在较高水平,而对照组已经恢复到处理前的水平。上述结果表明,在葡萄糖氧化刺激时,糖尿病血管收缩时间延长,这与血管平滑肌细胞△Ψm持续升高有关。结论本研究的主要发现:1.葡萄糖氧化通过增加血管平滑肌△Ψm引起血管收缩。2.△Ψm-miro介导的ROCK-MLC激活引起血管收缩,糖尿病血管平滑肌细胞△Ψm的持续升高介导了血管的张力增加。上述发现揭示了血管收缩功能的一种新的代谢调控机制,且其在糖尿病中的调节异常介导了糖尿病血管张力的增加,该发现为解释糖尿病血管并发症提供了新的理论依据。
[Abstract]:The changes of blood pressure , blood pressure and cardiac output in blood vessels were studied . 鐨勮��绠℃敹缂╂槸鐭�鏃舵�х殑,杩欎笌鍦ㄤ綋钁¤悇绯栧紩璧风殑琛，

本文编号：2074502