线粒体自噬在急性高糖导致的肾小管损伤中的作用机制

发布时间：2018-06-29 15:40

  本文选题：急性高糖 + 肾小管　； 参考：《天津医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:急性高糖的危害一方面和急性代谢紊乱所造成的一系列病理生理变化有关,如糖尿病酮症和糖尿病高渗性高糖状态;另外,还可一过性抑制胰岛β细胞的胰岛素分泌功能,即胰岛β细胞“急性高糖毒性”。然而近期研究发现,急性高糖还可导致急性“肾毒性”损伤。我们前期通过建立清醒大鼠急性高糖模型,发现急性高糖(16.7mmo/L)可导致大鼠明显肾脏损伤,主要表现为不同程度的肾小管结构和功能损伤,伴线粒体受损和氧化应激反应增强,具体机制不清。细胞主要通过自噬清除受损细胞器等成分,自噬在急性器官损伤中起关键作用,线粒体自噬障碍可导致细胞ROS增多,加重细胞损伤。本研究拟在前期研究基础上,进一步探讨:1.急性高糖导致大鼠肾小管损伤的浓度依赖关系。2.急性高糖导致大鼠肾小管损伤是否可逆。3.线粒体自噬及其调节通路AMPK-m TOR在急性高糖导致肾小管损伤中的作用机制。方法:1.以SD大鼠为研究对象:(1)急性高糖的浓度梯度研究:大鼠随机分为四组:对照组,高糖组A(11.1mmol/L),高糖组B(16.7mmol/L)和高糖组C(25.0mmol/L),每组10只;(2)可逆性研究:大鼠随机分为四组:对照组(生理盐水),高糖组B(16.7mmol/L 6h,24h处死),高糖组B1(16.7mmol/L 6h,48h处死)和高糖组B2(16.7mmol/L 6h,72h处死),每组10只。2.大鼠麻醉后行颈静脉置管术,5天后行高糖钳夹实验。高糖组大鼠50%葡萄糖溶液以0.25g/(kg·min)的速度泵入,使血糖迅速上升,后以一定速度持续泵入,每5min测定一次血糖,使血糖维持于目标水平,对照组以同等速度泵入生理盐水溶液,实验持续6h。3.留取血清及肾脏组织,光镜和透射电镜观察肾小球、肾小管病理结构变化;电镜观察肾小管上皮细胞自噬小体形成;生化法检测大鼠血清肌酐、尿素氮、肌酐清除率和24h尿微量白蛋白(UMA)水平;生化法和ELISA方法检测尿β2-微球蛋白(β2-MG)、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、半乳糖苷酶(GAL)、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)和胱抑素(Cys C)水平;Western blot及RT-PCR法检测自噬指标P62、LC3-II/LC3-I及线粒体自噬指标BNIP3L/Nix的水平;Western blot及RT-PCR法检测钠葡萄糖转运蛋白SGLT-2的表达;Western blot法检测AMPK、m TOR磷酸化水平。4.以大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E细胞为研究对象,不同浓度葡萄糖(5.5mmol/L、11.1mmol/L、16.7mmol/L、25.0mmol/L)干预6h,MTT法检测细胞活力;提取总RNA和总蛋白,RT-PCR及Western blot法检测自噬指标P62、LC3-II/LC3-I及线粒体自噬指标BNIP3L/Nix的水平,Western blot及RT-PCR法检测钠葡萄糖转运蛋白SGLT-2的表达;Western blot法检测AMPK、mTOR磷酸化水平。5.线粒体自噬调节通路细胞实验:设置对照组(5.5mmol/L),高糖组B(16.7mmol/L),AMPK激动剂组(16.7mmol/L葡萄糖+AICAR)和m TOR抑制剂组(16.7mmol/L葡萄糖+雷帕霉素),分别干预6h,提取细胞总RNA和总蛋白,Western blot及RT-PCR法检测自噬指标P62、LC3-II/LC3-I及线粒体自噬指标BNIP3L/Nix的水平;Western blot及RT-PCR法检测钠葡萄糖转运蛋白SGLT-2的表达;Western blot法检测AMPK、m TOR磷酸化水平。结果:1.成功建立大鼠急性高糖模型,高糖组大鼠血糖分别维持于11.1mmol/L,16.7mmol/L、25.0mmol/L左右,对照组大鼠血糖维持于4-6 mmol/L。2.HE染色:11.1mmol/L的急性高糖即可导致大鼠肾小管上皮细胞肿胀、结构紊乱,且损伤随血糖浓度升高逐渐加重;电镜结果示三个不同浓度的急性高糖均可导致大鼠肾小球足突局灶性融合、内皮细胞膜孔开大,部分细胞核呈凋亡样改变,肾小管上皮细胞迷路结构不清晰,线粒体嵴结构不清晰,出现自噬泡、自噬溶酶体,且随血糖浓度升高,自噬泡、自噬溶酶体有逐渐增多的趋势。3.HE染色示解除高糖作用24h后,观察到肾小管上皮细胞肿胀、管腔狭窄最为明显,随着时间延长(48h,72h)肾小管损伤逐渐减轻,但未完全恢复至正常(72h肾小管仍有轻度肿胀);电镜结果示急性高糖干预后,24h、48h时观察到肾小球足突融合、内皮细胞凋亡、肾小管排列紊乱、线粒体肿胀等损伤最为明显;与48h和24h相比,72h时肾小球、肾小管损伤有减轻的趋势,但未完全恢复至正常(肾小球仍有部分足突融合、内皮细胞膜孔开大,肾小管线粒体轻度肿胀)。4.与对照组相比,三组不同浓度急性高糖均可导致正常大鼠24h尿UMA明显增加(P0.05),但对血肌酐、尿素氮和肌酐清除率等未见明显影响(P0.05);肾小管上皮细胞损伤的指标NAG、NGAL、GAL、Cys C、及β2-MG有不同程度升高(P0.05)。5.正常大鼠经16.7mmol/L的急性高糖干预6h后去除高糖作用,进一步观察肾脏损伤的可逆性变化:与对照组相比,24h时大鼠24h尿UMA明显增加(32.37±3.65 vs 10.25±0.84μg/24h,P0.05),72h时呈下降趋势(12.15±1.34vs 32.37±3.65μg/24h,P0.05);但对血肌酐、尿素氮和肌酐清除率等未见明显影响(P0.05);肾小管上皮细胞损伤的指标NAG、NGAL、GAL、Cys C及β2-MG在24h时明显升高(P0.05),72h时出现下降,但与对照组相比,并未完全恢复(NAG 10.58±2.38 vs 4.85±3.75 U/L,P0.05;NGAL 1.63±0.56vs 0.72±0.11 ng/m L,P0.05;GAL 22.49±5.98 vs 16.50±0.71 U/L,P0.05;Cys C 123.01±17.24 vs 24.93±12.69 ng/m L,P0.05;β2-MG 0.043±0.010 vs0.026±0.011 mg/L,P0.05)。6.与对照组相比,三个不同浓度急性高糖均可导致大鼠自噬指标P62表达增加、LC3-II/LC3-I比值降低、线粒体自噬指标BNIP3L/Nix的表达增加(P0.05),SGLT-2的表达增加、AMPK磷酸化水平下降、m TOR磷酸化水平上升(P0.05)。7.不同浓度急性高糖可上调NRK-52E细胞自噬指标P62表达,下调LC3-II/LC3-I比值,上调线粒体自噬相关指标BNIP3L/Nix、SGLT-2的表达及m TOR磷酸化水平,下调AMPK磷酸化水平(P0.05)。8.与高糖组(16.7mmol/L)相比,AMPK激动剂和m TOR抑制剂均可上调自噬相关指标LC3-II/LC3-I比值,下调自噬指标P62及线粒体自噬指标BNIP3L/Nix表达(P0.05)。结论:1.急性高糖可导致肾脏结构和功能损伤,这种损伤在血糖浓度达到11.1mmol/L时即已出现,且以肾小管损伤为主;急性高糖导致的肾脏损伤呈浓度依赖性,即血糖浓度越高损伤越重。2.急性高糖导致的肾小管损伤具有可逆性,随着解除高糖作用时间的延长,肾小管损伤逐渐恢复。3.在急性高糖导致的肾小管损伤中,肾小管上皮细胞线粒体自噬受到抑制,且与血糖浓度相关,血糖浓度越高,线粒体自噬抑制程度越重。4.AMPK/m TOR信号通路参与急性高糖导致的肾小管上皮细胞线粒体自噬的抑制调节。
[Abstract]:Objective : To study the effects of acute high glucose on renal tubular injury in rats . The expression of SGLT - 2 was detected by Western blot and RT - PCR . Western blot and RT - PCR were used to detect the levels of self - phagocytic index P62 , LC3 - II / LC3 - I and mitochondrial autophagy index BPN33L / Nix . Western blot and RT - PCR were used to detect the levels of self - phagocytic index P62 , LC3 - II / LC3 - I and mitochondrial autophagy index BPN33L / Nix . Western blot and RT - PCR were used to detect the expression of SGLT - 2 . The results of electron microscopy showed that acute hyperglycose at 24 h and 48 h could result in a significant increase in renal tubular epithelial cells ( P < 0.05 ) , but not completely recovered to normal ( after 48 h , 72 h ) . 鍙娢，

本文编号：2082586