硫化氢治疗肥胖性肾损伤的分子机制

发布时间：2018-07-17 21:32

【摘要】：研究背景代谢综合征已成为人类所面临的主要亚健康问题之一,主要表现为肥胖、血压升高、甘油三酯升高、心血管疾病、空腹血糖升高、慢性炎症等多种代谢紊乱。近年来的研究表明代谢综合症对肾脏的功能有一定的损害作用,而肾脏在受损之后又反过来加重了代谢综合症的发展。研究表明:肥胖是代谢综合征的主要诱因,肥胖不仅能诱发糖尿病、高血压及胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR),肥胖能够导致肾脏损伤。由肥胖引起的肾损伤在医学上统称为肥胖相关性肾病(Obesity-related glomerulopathy,ORG),有报道称ORG的临床表现为血压升高、血脂升高和微量白蛋白尿出现,病理改变主要为肾小球的体积增大或者肾小球局部出现结节性硬化,是肾脏病的早期发展特征[1,2]。慢性肾脏病(Chronic kidney diesease,CKD)的防治已成为全球所面临的重大公共健康问题。2012年,Luxia Zhang等人的调查报告指出:在中国,CKD病人的人数在逐年增加,CKD也已经成为了危害公众健康的重大问题,特别在一些人口密集的农村地区,人数还在逐年递增[3]。CKD病人的不断增加,给全球经济带来了巨大负担,因此,寻求可靠的治疗方法来改变它的一些危险因素,如血脂异常,已成为研究CKD的一个主要方面。硫化氢一直被认为是一种有恶臭的毒性气体,直到1990年,有人证明硫化氢(H2S)可以作为调节神经功能的一种神经递质,能够由细胞中的硫化氢合成酶,利用半胱氨酸为原料进行合成,硫化氢作为内源性的气体信号分子才广泛被人们接受(或认知)[4]。随着对硫化氢生理功能研究不断深入,硫化氢对代谢性疾病的预防和治疗作用的研究也广泛展开,例如硫化氢对高血压的作用,对动脉粥样硬化的改善已经取得了可喜的结果。硫化氢对肾脏损伤的研究也已开展了大量的研究,例如在急性肾损伤中,硫化氢对肾脏损伤的保护作用研究。然而,硫化氢对肥胖引起的慢性肾功能损伤是否具有保护作用还不清楚[5-7]。为此,我们首先用高脂饲料喂养小鼠诱导肥胖,建立肾损伤模型,然后再给予硫化氢,检测肾功能;肾损伤的发生常伴着炎症反应,为此,我们检测炎症因子和NF-κB信号途径,研究炎症因子在慢性肾损伤中的作用。目的1、建立肥胖引起的小鼠慢性肾脏损伤模型;2、确定硫化氢对肥胖诱导的小鼠慢性肾损伤具有抗炎作用;3、分析硫化氢对肥胖诱导小鼠慢性肾损伤的保护作用机制。方法1、建立肥胖引起的小鼠肾脏慢性损伤模型所有的动物实验都是根据河南大学动物保护协会和伦理委员会的道德准则进行的。8周龄C57BL/6雄性实验小鼠是从南京大学模式动物研究所购买,在河南大学医学院分子医学实验室的动物饲养中心,适应性喂养一周,进行分组(低脂饲养组和高脂饲养组)造模和硫氢化钠(Sodium Hydrosulfide,Na HS,H2S的供体)治疗。2、小鼠生活习性的观察及体重测量小鼠经腹腔内注射治疗后,每隔2日检查一次小鼠的状况,如觅食、运动程度、精神状态、皮毛光泽度等情况,并每周监测小鼠体重和进食、进水量的变化,实验结束时进行OGTT检测,然后处死小鼠,收集血液和组织材料,分别冷冻或固定保存。3、血液生化指标检测小鼠血浆用Cobas8000罗氏全自动生化免疫血清工作站检测分析,主要检测血浆血液中的半胱氨酸酶抑制剂(又叫胱抑素C,Cys C),尿素(Urea),肌酐(Creatinine),甘油三酯(TG),总胆固醇(TC),高密度脂蛋白(HDL-C),低密度脂蛋白(LDL-C)。然后利用ELISA方法检测KIM-1指标。4、血浆和肾组织匀浆液中的细胞因子及TG的检测利用ELISA方法检测血清TNF-α和KIM-1指标,检测肾组织匀浆液中的TNF-α、KIM-1、IL-6、MCP-1、IL-10的含量。检测组织中的甘油三脂(TG)和总蛋白(TP),计算出肾脏中TG/TP的含量及变化。5、组织学形态观察小鼠经用1-3%戊巴比妥钠盐针剂麻醉后,先进行心脏取血,收集血液,接着取出活体组织。肾脏组织进行石蜡切片,切片经苏木精—伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色和PAS(Periodic Acid-Schiff)染色,以及使用Masson染色,观察肾脏组织损伤,肾小管损伤以及肾小球基底膜变化情况等。6、RT-PCR检测取冰冻肾脏组织,提取总的RNA,用RT-PCR进行检测硫化氢合成酶CBS、CSE、3-MST的m RNA表达变化,检测TNF-α、IL-6、MCP-1、KIM-1、IL-10等在肾脏中的基因表达情况。7、Western Blot检测用RIPA裂解肾脏组织,用BCA法进行总蛋白定量检测。Western Blot检测肾脏组织中NF-κB亚基p50/p65和磷酸化的p65的蛋白含量,以及TNF-α蛋白表达水平。结果1、持续4周腹腔内注射硫氢化钠溶液治疗后,与HFD+NS组相比,HFD+Na HS组小鼠的体重减少。2、持续4周腹腔内注射硫氢化钠溶液治疗后:(1)与LFD+NS组相比,HFD+NS组小鼠的血浆中Cys C、KIM-1、TG、TC含量明显升高、HDL-C含量降低;(2):与HFD+NS组相比,HFD+Na HS组小鼠的血浆中Cys C、KIM-1、TG、TC含量降低、HDL-C含量升高;(3):血尿素、血肌酸酐四组两两相比无明显差异。3、持续4周腹腔内注射硫氢化钠溶液治疗后,与HFD+NS组相比,HFD+Na HS组小鼠的肾小球体积变小,鲍曼氏腔隙变宽,肾小球局灶结节化等病理变化都有所好转。4、持续4周腹腔内注射硫氢化钠溶液治疗后:(1):与LFD+NS组相比,HFD+NS组的小鼠肾组织中TNF-α、IL-6、MCP-1的含量升高,RNA表达水平增加;(2):与HFD+NS组相比,HFD+Na HS组小鼠的肾脏中TNF-α、IL-6、MCP-1的含量降低,基因表达水平下降,IL-10的分泌量增加和基因表达水平升高;(3):与HFD+NS组相比,HFD+Na HS组的p65/p50的蛋白表达含量减少,同时TNF-α的蛋白表达含量下降。结论硫化氢可以通过下调p50和p65以及Phos Pho-p65的蛋白表达,抑制炎症细胞因子TNF-α和IL-6等因子的合成和分泌,促进抗炎性细胞因子IL-10的表达水平,从而肥胖小鼠的慢性肾损伤起到保护作用。
[Abstract]:The study shows that obesity is the main cause of metabolic syndrome , and obesity can not only induce diabetes , hypertension and insulin resistance ( IR ) . In 1990 , it has been shown that hydrogen sulfide ( H2S ) can be used as a neurotransmitter to regulate nerve function , and hydrogen sulfide ( H2S ) can be used as a neurotransmitter to regulate nerve function , hydrogen sulfide synthetase in cell can be used as raw material to synthesize , and hydrogen sulfide is widely accepted by people as endogenous gas signal molecule ( or cognition ) . In order to study the effects of hydrogen sulfide on renal injury induced by obesity , we studied the effects of hydrogen sulfide on kidney injury . The levels of TNF - 伪 , IL - 6 , IL - 6 , MCP - 1 , IL - 10 in renal tissue were measured by ELISA . The levels of TNF - 伪 , IL - 6 , MCP - 1 , MCP - 1 , IL - 10 were measured by ELISA . ( 2 ) Compared with HFD + NS group , the contents of TNF - 伪 , IL - 6 , MCP - 1 in renal tissues of HFD + NS group decreased , the level of IL - 6 and MCP - 1 decreased , the level of IL - 10 secretion increased and the level of gene expression increased , and ( 3 ) : Compared with HFD + NS group , the levels of TNF - 伪 , IL - 6 and MCP - 1 in HFD + NS group were decreased . Conclusion Hydrogen sulfide can inhibit the synthesis and secretion of TNF - 伪 and IL - 6 , and promote the expression of anti - inflammatory cytokines IL - 10 .
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R589.2

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本文编号：2131001