PKR激活通过SUMO化修饰上调P53抑制胰岛β细胞增殖

  本文关键词：亮氨酸对2型糖尿病的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

《南京医科大学》 2015年

PKR激活通过SUMO化修饰上调P53抑制胰岛β细胞增殖

宛晓梦  

【摘要】：目的:PKR(double-stranded RNA-dependent protein kinase)是双链RNA依赖性蛋白激酶,参与多种刺激因子介导的细胞周期阻滞和生长抑制。PKR的激活能通过抑制胰岛β细胞增殖和阻滞细胞周期G1期参与2型糖尿病的发病过程。研究表明,细胞周期抑制蛋白P53的上调是PKR激活诱导胰岛β细胞增殖抑制的重要信号分子,而其调控机制并不清楚。本研究旨在探讨PKR通过SMUO化上调P53途径诱导胰岛β细胞周期阻滞的调控机制。方法:采用转染wt-PKR质粒构建PKR过表达的MIN-6(小鼠)胰岛β细胞系。使用低浓度BEPP(1μM),糖脂毒性(16.7m M葡萄糖+0.1m M棕榈酸)或前炎症因子TNF-α(80n M)刺激MIN-6细胞,诱导PKR特异性激活。Ed U荧光标记、Hoechst 33258染色和流式细胞术分别评价胰岛β细胞的增殖以及细胞周期进程的变化。免疫印迹检测p-PKR和p-e IF-2α蛋白水平来分析PKR是否激活。免疫共沉淀技术检测PKR-Ubc9,P53-Ubc9及P53-SUMO-1蛋白结合水平继而分析P53的SUMO化修饰,并采用免疫印迹检测SUMO-1,Ubc9及P53蛋白表达,对P53进行蛋白半定量分析,且运用免疫荧光观察PKR和Ubc9的细胞共定位。最后给予PKR抑制剂2-AP,神经酰胺合成酶抑制剂FUMO B1及SUMO化修饰抑制剂Spectomycin B1预处理MIN-6细胞,重复上述实验,探讨其相关分子机制。结果:在PKR过表达的MIN-6细胞中,低浓度BEPP、糖脂毒性及前炎症因子TNF-α均能特异性激活PKR,使PKR和e IF-2α发生磷酸化。PKR的激活能够抑制胰岛β细胞增殖,并使其细胞周期阻滞于G1期。其周期阻滞的主要机制是激活的PKR与Ubc9相互结合,激活的Ubc9能作为SUMO E2连接酶诱导P53发生SUMO化修饰。同时发现PKR和Ubc9主要共定位于胞浆。Spectomycin B1能抑制P53的SUMO化修饰和蛋白水平上调。同样,给予PKR抑制剂或神经酰胺合成酶抑制剂FUMO B1也可以通过抑制PKR活化和第二信使神经酰胺积累来抑制P53的SUMO化修饰。结论:本研究揭示了2型糖尿病存在的诱发风险因素,能激活ceramide/PKR/Ubc9信号通路,通过促进P53的SUMO化修饰上调P53蛋白水平和蛋白稳定性,抑制胰岛β细胞周期G1期和细胞增殖,参与了机体胰岛β细胞整体功能障碍调控,而其功能失代偿促进了2型糖尿病的发生和病程发展。

【关键词】：
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1
【目录】：

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