体外实验探讨miR-638对脂质代谢的影响

发布时间：2018-11-01 11:51

【摘要】：背景脂质代谢紊乱是中国人群沉重的健康负担。在中国人群中开展的流行病研究结果表明,变化的生活方式、饮食结构与遗传因素相互作用,共同导致总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)水平增高、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低。胆固醇是细胞膜的重要组成成分之一,在脂质双分子层中起到结构支持及功能调节的作用,同时还是类固醇激素和胆汁酸合成的前体物质。人体内大多数类型的细胞无法分解代谢胆固醇,因此需要通过胆固醇合成、酯化、摄取及外流至循环中脂蛋白等各个环节保持着细胞内胆固醇的稳态。microRNA (miRNA)是在进化上高度保守的小分子非编码单链RNA,长度约为18-25个核苷酸。在基因的调控,尤其是转录后调控中起到重要作用。一个miRNA通常可以调控很多靶基因,参与到信号通路转导的多个环节中,因此使得miRNA成为强大的生物调控因子。很多研究通过基因敲除miRNA小鼠模型或化学合成miRNA的模拟物或者抑制物来研究miRNA在心血管疾病发生及发展过程中所起到的作用。本课题前期研究主要从人类血浆miRNA的差异性表达入手,通过miRNA芯片技术筛选出血浆中与HDL代谢相关的循环miR-638,并通过生物信息学靶点预测及后续细胞实验证实与脂质代谢相关的类固醇激素合成急性调节蛋白相关脂类转运结构域蛋白10(StarD10)为miR-638的靶基因,为进一步探讨miR-638对脂质代谢相关基因表达的影响提供了研究基础。目的该部分研究旨在进一步探讨miR-638对脂质代谢相关基因表达的影响。方法为了进一步探讨miR-638在脂质代谢中的作用,本研究分别在HepG2和巨噬细胞中转染miR-638模拟物和抑制物。通过对浓度及时间的摸索,最终确定使用模拟物和抑制物浓度为20nM,处理时间48小时。该浓度及时间能有效的升高或者降低细胞内miR-638的含量。随后利用包含84种参与到脂蛋白转运及胆固醇代谢中的关键基因的人类脂蛋白信号和胆固醇代谢的RT2 ProfilerTM PCR Array芯片检测转染了miR-638模拟物和抑制物后细胞内脂质代谢相关基因表达的变化水平,并利用Real-time PCR和Western blot技术在RNA及蛋白质水平进一步验证芯片结果。结果在HepG2细胞和巨噬细胞中转染miR-638模拟物后能显著增加细胞中miR-638的表达水平,在HepG2细胞中转染miR-638抑制物后能显著降低细胞中miR-638的表达水平。目前已证实在HepG2细胞及巨噬细胞中转染miR-638模拟物后能降低三磷酸腺苷结合盒转运子A1 ( ABCA1 ),三磷酸腺苷结合盒转运子G1 (ABCG1 )和极低密度脂蛋白受体(VLDLR)的RNA及蛋白质表达水平,而转染miR-638抑制物能升高HepG2细胞中ABCA1和ABCG1的RNA及蛋白质表达水平。结论miR-638能够对HepG2细胞和巨噬细胞中脂质代谢相关基因的表达产生影响。背景动脉粥样硬化是主要的心脑血管疾病包括冠心病、脑卒中等的共同基础病变,也是严重危害我国人民身体健康甚至导致死亡的最主要原因。血浆中过多的胆固醇在动脉内皮下沉积形成粥样斑块,斑块破裂后形成继发血栓堵塞动脉管腔,导致心肌缺血或坏死。胆固醇是哺乳类动物细胞膜的主要成分之一,在细胞增殖、胆汁酸及激素的生物合成当中发挥重要作用。高密度脂蛋白(HDL)能够将外周组织及动脉壁中多余的胆固醇转运到肝脏,促进其经胆汁途径排泄,因而在维持胆固醇代谢动态平衡的过程中发挥重要作用,这一过程又称为胆固醇逆转运(RCT)。因此,RCT被认为是一种重要的动脉粥样硬化保护过程。很多研究表明,microRNA能够参与到调控RCT的过程中。本课题前期研究发现血浆内miR-638与HDL水平相关。与血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)正常组相比,低HDL-C组miR-638表达升高,且差异具有统计学意义,为进一步探讨miR-638在RCT中的作用提供了研究依据。目的该部分研究旨在进一步探讨miR-638对细胞内胆固醇外流的影响。方法用miR-638模拟物/抑制物及miR-638模拟物/抑制物阴性对照处理HepG2细胞和巨噬细胞,并使细胞负载100μg/mL的ox-LDL后孵育NBD-胆固醇。分别使用ApoAI诱导外流液、HDL诱导外流液和标准血清诱导外流液诱导细胞胆固醇外流。使用荧光酶标仪检测诱导外流液和细胞裂解液的荧光强度,并根据公式计算NBD-胆固醇外流率。结果在HepG2细胞中,miR-638模拟物能抑制ABCA1介导的胆固醇外流至ApoAI和ABCG1介导的胆固醇外流至HDL,而miR-638抑制物能够促进改ABCA1介导的胆固醇外流至ApoAI和ABCG1介导的胆固醇外流至HDL。在巨噬细胞中miR-638模拟物能够抑制ABCA1介导的胆固醇外流至ApoAI。结论miR-638模拟物能够抑制细胞内胆固醇外流,而miR-638抑制物能够促进细胞内胆固醇外流。
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【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R589.2

【参考文献】