MicroRNA-223对糖尿病心肌纤维化EndMT的影响

发布时间：2018-11-09 19:59

【摘要】：研究背景：糖尿病心肌纤维化作为糖尿病的重要并发症之一,与心血管疾病的高发病率和死亡率密切相关。纤维化以成纤维细胞积聚及细胞外基质堆积特征,可导致心脏结构和功能失调,引起心血管疾病的发生发展。研究指出内皮细胞转化(EndMT)在心肌纤维化病理改变过程中发挥重要作用。EndMT是内皮细胞失去其特性(细胞连接、侵袭、迁移能力等)并转化为间叶细胞或成纤维细胞样细胞的过程。文献报道microRNA-223在冠状动脉疾病、急性冠脉综合征、肺动脉高压等多种心血管病中有一定作用,同时也有资料显示microRNA-223在胰腺癌中与上皮细胞转化(EMT)有关,但microRNA-223是否参与心肌纤维化尚未有确切的研究,本实验主要探讨糖尿病心肌纤维化过程中miR-223与EndMT的相互关系及作用机制。研究目的：(1)研究microRNA-223在心肌纤维化中的作用；(2)研究microRNA-223与EndMT的相关性及机理。研究方法：1.细胞模型的建立：研究指出30mmol/L高糖(HG)可通过EndMT诱导内皮细胞损伤,而且EndMT可引起心肌纤维化。在本实验中,选取人主动脉内皮细胞(HAECs)培养,培养基选用内皮细胞专用培养基ECM,在培养瓶或者六孔板中转入过表达病毒LV-hsa-mir-223-3psponge (miR-223)以及阴性对照病毒,在细胞密度达80%左右时给予细胞刺激,即将细胞分组为NG组、HG组、HG+ miR-223组、HG+ LV-CN组,持续刺激72小时后处理细胞。2. Western Blot:细胞经提取蛋白、电泳、转膜、免疫反应、发光后观察miR-223靶基因PARP-1、EndMT标志物(α-SMA, VE-cadherin, eNOS, CD31)以及炎症标志物(TNF-a,VCAM1,ICAM1)的表达情况。3. RT-PCR:细胞给予持续刺激后通过Trizol法提取RNA、反转录及扩增后观察高糖刺激后miR-223及靶基因PARP-1表达量是否有变化,并与转入过表达病毒后做对比。4.细胞免疫荧光：选取生长状态良好的HAECs种在已放入细胞爬片的24孔板中,经一系列反应后通过荧光倒置显微镜观察EndMT标志物(a-SMA, VE-cadherin, eNOS, CD31)是否有变化以及细胞形态等变化。5.细胞活性检测：给予刺激的细胞通过CCK-8试剂盒经酶标仪检测细胞活力,观察高糖刺激后细胞活性是否有改变以及转染病毒后细胞活力及数量是否有改善。6.细胞划痕试验：在已长满细胞的六孔板内垂直划三条平行线,观察内皮细胞的迁移能力。7.细胞transwell试验：计数上室细胞(无血清培养基)穿过小室聚碳酸酯膜进入下室(有血清培养基)的细胞数量,反映内皮细胞的迁移能力。8.数据分析：运用统计学SPSS 19.0软件,数据用平均值±标准差(x±s)表示,经t检验,p0.05有统计学意义。研究结果：1.MiR-223在经高糖诱导的主动脉内皮细胞中的表达与正常糖含量的NG组相比较,主动脉内皮细胞在经高糖刺激后,通过PCR技术检测发现miR-223在细胞中的表达量下降。经过表达病毒转染后,miR-223表达水平升高,阴性对照组与高糖组比较无明显变化。2.MiR-223改善细胞活力和影响细胞的迁移能力经CCK-8试剂盒检测发现,高糖诱导的内皮细胞活力下降,而转染过表达病毒后细胞活力改善,病毒阴性对照组较过表达组活力较低。Transwell试验发现高糖刺激后的内皮细胞穿过小室的数量较miR-223过表达病毒组明显增多。为了进一步研究主动脉内皮细胞的迁移能力,进行划痕实验。划痕试验发现高糖刺激后的内皮细胞迁移能力增强,距离变窄的速度较miR-223过表达病毒组快,与transwell试验结果相一致。3. PARP-1可能是miR-223的一个靶基因经PCR发现,高糖刺激组PARP-1表达量升高,miR-223表达量下降,转染过表达病毒后miR-223表达水平提高,而PARP-1表达水平下降。MiR-223表达水平与PARP-1呈负相关。4.MiR-223可延缓EndMT的进展经WB及免疫荧光发现,高糖刺激组内皮细胞标志物VE-cadherin, eNOS,CD31表达量下降,而成纤维细胞标志物α-SMA表达量升高,转染病毒后α-SMA表达量下降,内皮细胞向成纤维细胞转型的程度降低。5.MiR-223可减轻炎症刺激经WB发现,高糖刺激内皮细胞后炎症因子TNF-α,VCAM,ICAM表达水平升高,转染过表达病毒后水平下降,减轻炎症因子对细胞的损伤。研究结论：1.MiR-223过表达可通过作用于靶基因PARP-1延缓EndMT2.MiR-223上调可改善糖尿病心肌纤维化的程度
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R542.2

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本文编号：2321411