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维生素D在成骨细胞骨分化中的分子机制及骨质疏松与动脉钙化相关性的临床研究

发布时间:2018-11-13 14:45
【摘要】:骨质疏松症是严重危害老年人群健康的慢性骨代谢病,其发病机制复杂,防治难度大。维生素D是体内调节骨代谢的一种重要激素,可通过间接作用和对成骨细胞的直接作用影响骨形成,因此维生素D在骨质疏松症的发病机制及防治中起重要作用。维生素D在体内的活性代谢产物1a,25-二羟维生素D[1,25(OH)2D]一方面可通过促进肠道钙吸收间接作用于骨形成。此外,成骨细胞表达维生素D受体(vitamin D receptor,VDR),也是1,25(OH)2D作用的重要靶器官。体外成骨细胞培养表明生理量的1,25(OH)2D可刺激成骨细胞分化、促进骨形成。但维生素D对成骨细胞直接调控的详细分子机制还有待深入研究。hnRNPC1/C2的经典角色是作为RNA结合蛋白在RNA加工中发挥多重作用,包括影响前体m RNA的剪接和选择性剪接。而本课题组的前期研究发现,hnRNPC1/C2还可与1,25(OH)2D/VDR复合物竞争,并结合位于1,25(OH)2D靶基因上游启动子区域的维生素D反应元件(vitamin D response elements,VDREs),在转录水平参与1,25(OH)2D介导的基因表达调控。鉴于上述hn RNPC1/C2对转录和RNA剪接的双重作用,我们推测hn RNPC1/C2可能作为偶联因子在转录和RNA剪接两个水平协调维生素D介导的成骨细胞基因表达调控。本研究的第一部分以人原代成骨细胞(primary human osteoblasts,h OBs)和MG63成骨细胞系为模型,结合转录组高通量测序手段,在转录和剪接水平探讨了hn RNPC1/C2对1,25(OH)2D介导的成骨细胞基因表达调控的影响。近年来的多项研究显示心血管系统疾病和骨质疏松症存在相关性,它们共同发生在老年期,经常在同一老年个体可见,且发病率都随着年龄的增长而增加。尽管老年是心血管疾病和骨质疏松共同的危险因素,但大多数研究发现,忽略年龄这一因素后,这两种疾病之间仍存在显著的联系。一方面,心血管系统疾病与骨量丢失及骨折风险增加有关,同样,有证据提示骨密度降低可导致心血管系统疾病的发病率和死亡率增加。进一步研究发现心血管疾病与骨质疏松在发病机制层面有紧密而直接的联系。动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要病理基础,而动脉钙化则是其主要表现之一。动脉钙化被认为是心血管疾病的一个重要标志物和临床监测指标。研究表明,血管钙化的本质是血管平滑肌细胞向成骨细胞表型的转化以及血管组织向骨组织的转化。而血管钙化的形成也和骨矿物质丢失具有显著的相关性。本研究的第二、三和第四部分通过对一组60岁以上老年人群的观察性研究,探讨了老年患者动脉钙化和骨质疏松及骨折之间相关性。研究方法第一部分1.使用hobs进行成骨诱导培养,并于hobs人工过表达hnrnpc1/c2,利用荧光定量pcr(qpcr)检测1,25(oh)2d诱导的runx2,bglap,spp1及col1a1等成骨标志基因的表达变化。2.使用mg63人成骨细胞系,并以cyp24a1基因为研究对象,采用染色质免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)以及rna免疫共沉淀(rnaimmunoprecipitation,rip)技术,验证vdr和hnrnpc1/c2与cyp24a1基因上游启动子区域vdres以及cyp24a1mrna的相互作用。3.通过rna干扰(rnainterference,rnai)手段在mg63人成骨细胞沉默hnrnpc1/c2,并采用qpcr以及荧光标记pcr,在转录和剪接水平检测hnrnpc1/c2沉默对1,25(oh)2d调控的cyp24a1的基因表达影响。4.最后,通过对mg63成骨细胞的高通量rna测序(rna-seq)结合生物信息学方法对基因的差异表达及选择性剪接进行分析,在全基因组水平探讨了1,25(oh)2d与hnrnpc1/c2对基因表达和选择性剪接的作用以及这两个环节之间的相互联系。第二部分1.本研究从2012年1月1日到12月31日,筛选60岁以上符合条件的来院就诊患者为研究对象。2.主动脉钙化程度的半定量测量:应用腰椎x线侧位片对第1-4腰椎对应的腹主动脉钙化沉积物进行评分。根据钙化斑块的长度和累及的节段数,每位患者的主动脉钙化评分(acs)为0-24分不等,无主动脉钙化是0分,最严重的主动脉钙化是24分。并依据acs将患者分为4组:g1,acs=0;g2,acs=1-2;g3,acs=3-6;g4,acs6。3.骨密度检测使用双能x线吸收仪测量(dxa)。骨质疏松症定义为基于dxa测定的骨密度值低于同性别、同种族正常成年人骨峰值2.5个标准差或以上。4.采用多因素回归风险模型评估主动脉钙化和骨质疏松症发生风险的关系。第三部分1.与第二部分研究同期,筛选60岁以上符合条件的绝经后妇女为研究对象。2.主动脉钙化程度的半定量测量同第二部分。3.椎骨骨折的诊断:通过x线片观察椎体形态(胸4-腰5节段)确定椎骨骨折的发生(椎体高度下降20%以上)。4.采用多因素回归分析模型评估主动脉钙化和椎骨骨折之间的关系。第四部分1.与第二部分研究同期,筛选60岁以上符合条件的来院就诊患者为研究对象。2.骨密度检测及骨质疏松症的诊断同第二部分。3.颈动脉和冠状动脉粥样硬化钙化斑块检测:使用64排螺旋ct行颈动脉和冠状动脉cta。三维图像分析工作站评估所有cta图像。并对动脉斑块的成分和发生范围进行评价。4.采用多因素回归风险模型分析骨质疏松和骨量丢失与颈动脉和冠状动脉钙化斑块发生风险之间关系。结果第一部分1.hobs过表达hnrnpc1/c2显著抑制了1,25(oh)2d对成骨细胞骨形成标志基因runx2、bglap的激活。2.mg63成骨细胞中,hnrnpc1/c2与vdr竞争结合vdres;hnrnpc1/c2与cyp24a1mrna的结合则与vdr无关。3.mg63成骨细胞中,hnrnpc1/c2沉默在影响cyp24a1转录的同时导致cyp24a1异常选择性剪接的发生。4.rna-seq检测基因的差异表达:1,25(oh)2d处理mg63成骨细胞共检测出324个差异表达基因:其中有187个基因对1,25(oh)2d的反应不受hnrnpc1/c2沉默的影响,有137个基因在hnrnpc1/c2沉默后失去对1,25(oh)2d反应。而在hnrnpc1/c2沉默后,新出现168个1,25(oh)2d应答基因。5.rna-seq检测基因的选择性剪接:1,25(oh)2d处理mg63细胞共引起310个选择性剪接事件;1,25(oh)2d诱导的选择性剪接事件在hnrnpc1/c2沉默后增加(390个),而只有3个事件(1%)也出现在hnrnpc1/c2存在时1,25(oh)2d诱导所致的选择性剪接事件中。6.1,25(oh)2d处理导致的324个差异表达基因中,只有9个基因同时出现选择性剪接。与单独1,25(oh)2d处理相比较,hnrnpc1/c2沉默联合1,25(oh)2d处理导致第三部分有811个基因(22.7%/27.4%)同时出现差异表达和选择性剪接。第二部分1.1448例完成本项研究的老年受访者的平均年龄为72.0±4.5岁,有397例(27.4%)发生了骨质疏松症。2.与无骨质疏松症组相比,骨质疏松症组年龄更加老化、女性更多(p0.01);骨质疏松症组的椎骨、股骨颈、股骨粗隆和全髋部的骨密度更低(p0.01);血清i型原胶原n-端前肽(pinp)、i型胶原交联c-末端肽(ctx)水平更高(p0.05);总脱氧吡啶(totaldpd)、游离脱氧吡啶(freedpd)水平更高(p0.01);25羟维生素d[25(oh)d]水平更低(p0.01)。3.在调整年龄和其他潜在混杂因素以后,acs(g4)、bmd、25(oh)d、ctx、现在吸烟、每日饮酒与骨质疏松症的发生密切相关。骨质疏松症发生的风险随着acs的增加而升高,但只在acsg4组与g1组比较有统计学意义。较高的acs在女性和男性均与骨质疏松症的发生相关。第三部分1.在1359例绝经后妇女中,有173例(12.7%)发生了骨折,其中包括92例椎骨骨折,81例发生了非椎骨骨折。2.主动脉钙化组脊柱骨折的发生率明显高于无主动脉钙化组(p0.01)。3.在调整年龄等其他混杂因素后,发现骨密度、年龄、2次及以上跌倒史、25(oh)d、脂联素与椎骨骨折密切相关。与acsg1组相比,g3和g4组椎骨骨折发生风险更高。第四部分1.1393例老年受访者完成研究,其中474例发生动脉钙化斑块,包括158例(33.4%)颈动脉钙化斑块,195例(41.1%)冠状动脉钙化斑块和121例(25.5%)颈动脉和冠状动脉共存钙化斑块。2.在调整年龄等其他混杂因素后,骨质疏松症、低骨量、血25(oh)d水平下降与动脉钙化斑块的发生密切相关。3.在调整年龄等其它混杂因素后,严重的骨量丢失与颈动脉斑块、冠状动脉斑块及共存的钙化斑块的发生均显著相关。结论1.过表达hnrnpc1/c2显著抑制了1,25(oh)2d对成骨细胞骨形成标志基因runx2、bglap的反式激活;1,25(oh)2d可在转录和mrna剪接两个水平调控成骨细胞基因表达;hnrnpc1/c2可在转录和mrna剪接水平参与协调1,25(oh)2d对成骨细胞的基因表达调控。2.在老年人群中,严重的主动脉钙化与骨质疏松症的发生相关。骨质疏松症的发生风险随着ACS的增加而升高。骨密度降低和血25(OH)D水平下降也与骨质疏松症发生的相关。3.在老年绝经后妇女中,严重的主动脉钙化与椎骨骨折的发生相关。骨密度降低和血25(OH)D水平下降与椎骨骨折的发生相关。4.在老年人群中,骨质疏松症、低骨量及血25(OH)D水平下降与动脉钙化斑块的发生相关;严重的骨量丢失与颈动脉斑块、冠状动脉斑块及共存的钙化斑块的发生风险均相关。本研究揭示了维生素D对成骨细胞直接调控作用的新的分子机制,为认识维生素D在成骨细胞骨分化,骨代谢及代谢性骨病中的作用机制开启了一个全新的视角,对深入探索骨质疏松症的发病机制,寻找新的药物治疗靶点具有重要意义。同时,对一组老年人群的观察性研究揭示了老年病的一些共同危险因素及内在的相互关系,对骨质疏松症及心血管疾病的防治具有重要意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R580;R543.5

【参考文献】

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1 连星烨;孟增东;;不同地区光照量与人体维生素D水平及骨密度之间的关系[J];中国骨质疏松杂志;2012年02期



本文编号:2329476

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