【摘要】：目的:1.探索低浓度PCB118对大鼠甲状腺FRTL-5细胞活力和细胞凋亡的影响;2.探索低浓度PCB118对大鼠甲状腺FRTL-5细胞重要功能基因NIS mRNA,蛋白表达量及NIS启动子活性的影响;3.探索低浓度PCB118引起大鼠甲状腺FRTL-5细胞重要功能基因NIS基因及蛋白水平发生变化的可能的分子生物学机制。方法:1.将培养皿中培养的大鼠FRTL-5细胞消化计数后,铺于96孔板中,用空白对照(培养基),溶剂对照(DMSO)及不同浓度的PCB118(0,0.025,0.25,2.5,25,250,2500,25000nM/L)分别刺激24h,48h及72h后,行CCK-8实验,用分光光度计在450nm波长处测吸光度值,计算细胞活力。2.根据CCK-8实验结果,选择不影响细胞活力的低浓度PCB118(0,0.025,0.252.5,25nM/L)刺激FRTL-5细胞72h后,收集细胞上清,应用流式细胞术测定细胞凋亡率。3.不同低浓度PCB118(0,0.025,0.25,2.5,25nM/L)刺激FRTL-5细胞24h或48h后,RT-PCR方法检测细胞Akt,FoxO3a,NIS mRNA的表达水平,Western blotting方法检测细胞Akt,p-Akt,FoxO3a,p-FoxO3a及NIS蛋白表达水平。4.不同低浓度PCB118(0,0.025,0.25,2.5,25nM/L)刺激FRTL-5细胞48h后,荧光素酶报告基因的方法检测大鼠甲状腺FRTL-5细胞NIS及FoxO3a基因启动子活性。5.分别将持续激活型Akt(CA-Akt)质粒、负显性失活型Akt(DN-Akt)质粒及空白对照(BC)质粒转染大鼠甲状腺FRTL-5细胞,用0,25nM/L的PCB118刺激细胞48h后,提取蛋白后用Western blotting方法检测细胞p-Akt,p-FoxO3a及NIS蛋白表达水平。6.分别将FoxO3a-siRNA及其阴性对照(NC)质粒转染大鼠甲状腺FRTL-5细胞,用0,25nM/L的PCB118刺激细胞48h后,提取蛋白后用Western blotting方法检测细胞FoxO3a,p-FoxO3a及NIS蛋白表达水平。7.分别将pc DNA3-FoxO3a或其对照质粒pc DNA3与NIS基因启动子质粒共转染大鼠甲状腺FRTL-5细胞,用0,25nM/L的PCB118刺激细胞48h后,荧光素酶报告基因方法检测FoxO3a过表达后NIS基因启动子活性的变化。结果:1.PCB118刺激FRTL-5细胞24h,48h,72h,空白对照组FRTL-5细胞活力与溶剂对照组(DMSO)比较未见明显统计学差异(P0.05),相对低浓度PCB118处理组(0.025,0.25,2.5,25 nM/L)与溶剂对照组比较亦未见明显差异(P0.05),各处理组间比较也未见明显统计学差异(P0.05);而相对高浓度PCB118处理组(250,2500,25000 nM/L)与溶剂对照组比较,在刺激时间为48h和72h,细胞生存率可见明显降低,差异具有统计学意义(P0.05),在刺激时间为24h时,相对高浓度PCB118处理组(250,2500,25000 nM/L)的细胞生存率与溶剂对照组比较未见明显差异(P0.05)。2.与溶剂对照组比较,各PCB118处理组(0.025,0.25,2.5,25nM/L)细胞凋亡率未见明显差异(P0.05),各PCB118处理组间亦未见明显统计学差异(P0.05)。3.(1)不同低浓度PCB118(0.025,0.25,2.5,25nM/L)刺激FRTL-5细胞24h后,与溶剂对照组比较,各PCB118处理组Akt mRNA的表达水平均明显增加(P0.05),FoxO3a的mRNA表达水平未见明显变化(P0.05),而各PCB118处理组NIS mRNA表达水平均明显降低(P0.05);(2)不同低浓度PCB118(0.025,0.25,2.5,25nM/L)刺激FRTL-5细胞24h后,各PCB118处理组Akt,p-Akt,p-FoxO3a蛋白表达水平与溶剂对照组比较均明显增加(P0.05),FoxO3a蛋白表达水平未见明显变化(P0.05),而各PCB118处理组的NIS蛋白表达水平与溶剂对照组比较均明显降低(P0.05)。4.不同低浓度PCB118(0.025,0.25,2.5,25nM/L)刺激细胞48h后,NIS基因启动子活性与溶剂对照组比较可见明显降低(P0.05),而FoxO3a基因启动子活性与溶剂对照组比较可见明显增加(P0.05),各处理组间比较未见明显差异(P0.05)。5.CA-Akt质粒转染后,分别与溶剂对照及PCB118处理组的空白对照比较,浓度为25nM/L PCB118处理组p-Akt,p-FoxO3a蛋白表达量均显著增加(P0.05),NIS蛋白表达量均明显降低(P0.05);而在转染DN-Akt质粒后上述结果相反(P0.05)。6.用FoxO3a-siRNA转染细胞后,在溶剂对照组及25nM/L PCB118处理组,均可见FoxO3a及p-FoxO3a蛋白表达量有明显下调(P0.05);分别同溶剂对照及PCB118处理组阴性对照(NC)比较,FoxO3a-siRNA诱导FoxO3a表达水平的下调可导致25nM/L PCB118处理组NIS蛋白表达水平显著增加(P0.05)。7.将pc DNA3-FoxO3a或其对照质粒pc DNA3与NIS基因启动子质粒共转染大鼠甲状腺FRTL-5细胞后,分别同溶剂对照及PCB118处理组空白对照(BC)比较,25nM/L PCB118处理组NIS基因启动子活性均明显增加(P0.05)。结论:1.低浓度PCB118(0.025,0.25,2.5,25nM/L)处理细胞24h或48h后,对细胞活力及凋亡率均无影响;2.低浓度PCB118可通过Akt/FoxO3a/NIS信号转导通路引起甲状腺功能障碍。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R581
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本文编号：2353403
