磷酸化南极磷虾肽增加骨质疏松症大鼠的骨密度及其作用机制研究

发布时间：2018-12-08 08:12

【摘要】：骨质疏松症是一种以骨量降低,骨微结构破坏,导致骨脆性和骨折发生率增高的全身性骨病。绝经后骨质疏松症是骨质疏松症中最为常见的类型,它的显著特征表现为高骨转换型,即骨吸收与骨生成均处于活跃状态。目前全世界2亿多骨质疏松症患者中约有33%为绝经后妇女,而治疗骨质疏松症的药物副作用较大,因此需要寻找安全有效的抗骨质疏松活性物质。南极磷虾含有丰富的优质蛋白,蛋白质磷酸化是提高蛋白质功能的一种有效手段,磷酸基的导入会促进生物体对钙的吸收,但对于磷酸化蛋白改善骨质疏松的研究尚无报道。从南极磷虾蛋白中制备的南极磷虾肽具有多种生物活性,但关于磷酸化南极磷虾肽(phosphorylated peptides from Antarctic krill, PP-AKP)在抗骨质疏松活性方面的研究未见报道。因此,本论文采用双侧去卵巢手术建立骨质疏松症大鼠模型,系统研究了PP-AKP对骨质疏松症的改善作用,并阐明了其可能的作用机制,主要研究结果如下：从南极磷虾中制备的PP-AKP,其分子量范围为200-2000Da,蛋白含量为90.71%,磷含量为1.52%,氟含量为2.49ppm(符合食品安全国家标准)。模型大鼠灌胃PP-AKP 90d后,其血液、尿液生化指标结果显示,PP-AKP能显著降低模型大鼠血清中BALP活性和OCN、PICP含量,增加OPG含量,降低RANKL含量,降低RANKL/OPG比值,调控模型大鼠骨生成,抑制高骨转换速率,抑制骨吸收；PP-AKP能显著降低血清中TRACP、Cath-K活性和CTX-1含量,降低尿液中DPD、Ca、 P含量,抑制模型大鼠骨吸收,抑制胶原和矿物质的丢失。炎症因子能通过诱导破骨细胞前体细胞分化成破骨细胞,介导骨吸收。实验结果显示, PP-AKP能显著降低模型大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、NO含量和COX-2活性,抑制模型大鼠骨吸收。提示PP-AKP能显著抑制模型大鼠的高骨转换状态,抑制骨吸收。骨密度是诊断骨质疏松症的金指标。骨生物力学是全面评价骨质量,预测骨折发生的关键指标。实验结果显示,PP-AKP能显著增加模型大鼠股骨和胫骨骨密度,增加模型大鼠胫骨最大载荷和结构强度,提高生物力学性能。股骨组织学分析进一步显示,PP-AKP能显著增加骨小梁数目,增加骨小梁面积,降低骨小梁间距,修复骨组织网状结构,维持较高的骨连接。提示PP-AKP能提高模型大鼠的骨强度,减少骨折发生。成骨细胞在骨质疏松中起关键作用,它不仅介导骨生成,而且调控破骨细胞介导的骨吸收。其中经典的Wnt/β-catenin信号通路是成骨细胞介导骨生成的主要通路。qRT-PCR结果显示,PP-AKP能显著下调模型大鼠股骨Wnt/β-catenin信号通路中关键基因LRP-5b, β-catenin、RUNX2、 OSX mRNA的表达,显著下调COLI、OCN、ALP等成骨细胞功能相关基因mRNA的表达。Western blot结果显示,PP-AKP能显著抑制模型大鼠股骨LRP-5b、总β-catenin、核P-catenin、 RUNX2等蛋白的表达。提示PP-AKP通过下调Wnt/p-catenin信号通路,调控模型大鼠的骨生成,抑制模型大鼠高骨转换状态。OPG/RANKL/RANK通路在成骨细胞调控破骨细胞活性和功能方面起重要作用。NF-κB和MAPKs信号通路的激活是OPG/RANKL/RANK信号通路传递的特征标志。qRT-PCR结果显示,PP-AKP能显著上调模型大鼠股骨OPG mRNA的表达,显著下调RANKL mRNA的表达,对RANK mRNA的表达无显著影响；显著下调NF-κB通路中关键基因TRAF6、 NF-κB、 c-fos和NFATC1 mRNA的表达。Western blot结果显示,PP-AKP能显著上调模型大鼠股骨OPG的蛋白表达,显著下调RANKL、 TRAF6、 NFATC1的蛋白表达,显著下调P-NF-κB的蛋白表达水平,但对NF-κB总蛋白的表达无显著影响。提示PP-AKP能抑制OPG/RANKL/NF-κB信号通路的激活。另外,PP-AKP显著下调MAPKs通路中p38、 ERK、 JNK等mRNA的表达,显著下调p-p38的蛋白表达,但对p38总蛋白的表达无显著影响。提示PP-AKP能抑制OPG/RANKL/MAPKs信号通路的激活。Cath-K、 MMP-9和TRACP是破骨细胞吸收功能的标志性指标。结果显示,PP-AKP能显著抑制Cath-K、 MMP-9和TRACP mRNA的表达,显著抑制Cath-K和MMP-9蛋白的表达。综上结果显示,PP-AKP能通过抑制OPG/RANKL/NF-κB和OPG/RANKL/MAPKs信号通路的激活,抑制破骨细胞的分化成熟,抑制模型大鼠的骨吸收。本论文首次证明了PP-AKP增加骨质疏松症大鼠骨密度的作用,并对其作用机制进行了深入阐明,为南极磷虾的高值化利用和新型抗骨质疏松症相关的营养品、功能食品、药物等的开发提供了科学依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R580

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本文编号：2368017