GLP-1和大麻素受体与肥胖关系的研究及在棕色脂肪功能的探讨

发布时间：2019-03-14 14:07

【摘要】：第一部分:大麻素受体介导棕色脂肪功能改善能量代谢目的:肥胖的发病机理复杂,已有大量通过增强棕色脂肪功能来治疗肥胖的研究。而内源性大麻素系统与肥胖和胰岛素抵抗的关系密切。然而目前内源性大麻素系统能否通过增强棕色脂肪功能进而减轻肥胖尚不清楚。本研究通过对大麻素受体CB1基因敲除小鼠模型观察CB1受体对小鼠糖代谢、胰岛素敏感性、摄食量和代谢率以及棕色脂肪产热和糖脂代谢相关基因等的影响。方法:常规饲料喂养SPF级野生型WT小鼠和CB1基因敲除小鼠,每隔2-4周采用Echo MRI-100仪器进行磁共振(MRI)分析,通过全身扫描得到小鼠体脂含量(fat mass)和瘦体质(lean mass)含量结果。采用开放式Oxymax间接测热系统采集并分析小鼠摄食量相关指标、自主活动、能量消耗、呼吸商,随后口服糖耐量试验检测各组小鼠血糖和葡萄糖刺激的胰岛素释放水平。处死小鼠后将肩胛区棕色组织切片,行HE染色,观察棕色脂肪细胞形态,采用real-time PCR和western blot检测棕色脂肪能量代谢和糖脂代谢相关基因(UCP-1、PGC-1α、IR、IRS1、PPARy2)和蛋白表达水平。流式细胞仪检测WT小鼠和CB1基因敲除小鼠腹腔内巨噬细胞含量M1和M2。结果:从10周龄至第34周龄,CB1-/-小鼠与WT小鼠相比体重持续减轻;葡萄糖耐量试验结果显示CB1-/-小鼠在葡萄糖负荷后血糖上升的速度(Omin 127±8,15min481±21,30min 459±33,60min 409±37,120min191±24mg/dl)与 WT 小鼠(0min123±12,15min 427±26, 30min436±16,60min404±33, 120min 209±28mg/dl)相近(P0.05),而 CB1-/-小鼠(0min1.07±0.07,15min1.28±0.17,30min1.30±0.15,120min1.66±0.11ng/ml)胰岛素分泌水平低于 WT 小鼠(Omin 1.46±0.15,15min2.09±0.34,30min 1.88±0.19,120min 2.68±0.46ng/ml)(P0.05);胰岛素耐量试验结果显示 CB1-/-小鼠(Omin 166±4, 30min96±5,60min88±6, 90min111±10, 120min153±13mg/dl)血糖明显低于 WT 小鼠(0min181±3,30min137±11,60min135±13, 90min142±16,120min173±21mg/d1)(P0.05);与 WT 小鼠相比,CB1-/-小鼠摄食总量和自主活动无明显差异(P0.05);与WT小鼠相比,CB1-/-小鼠能量消耗高于WT小鼠(P0.05); HE染色结果显示,WT小鼠脂肪细胞的平均大小为853.2± 109.5μm2,而CB1-/-小鼠肩胛棕色脂肪细胞的平均大小为693.4±148.5μm2,差异有统计学意义(P0.05);棕色脂肪组织基因分析结果显示,CB1-/-小鼠产热和糖脂代谢关键的因子(UCP-1、PGC-1α、IR、IRS1、PPARy2)均显著高于WT小鼠(P0.05);流式细胞结果显示CB1小鼠腹腔内巨噬细胞与WT小鼠相比,M1减少,M2增多,M1/M2减少(P0.05)。结论:正常饲料喂养的CB1基因敲除组小鼠体重、体脂含量较正常小鼠明显减轻,胰岛素敏感性增加。虽然CB1基因敲除小鼠摄食的模式有所改变,但是摄食总量、自主活动较正常小鼠无明显减低。进一步通过代谢分析发现,CB1基因敲除小鼠无论是白天还是夜间,能量消耗增加;同时与产热糖脂代谢相关的基因和蛋白在棕色脂肪表达明显增加。因此,本实验证实CB1受体敲除小鼠可能是通过增强棕色脂肪功能而体重减轻的。第二部分GLP-1受体激动剂增强高脂喂养的小鼠棕色脂肪功能目的:近来研究发现GLP-1受体激动剂不仅具有降血糖作用,而且还能减重,但是目前其减重机制尚未阐明。本研究通过高脂饮食喂养的C57BL/6J小鼠模型,观察GLP-1受体激动剂对小鼠体重、糖代谢、胰岛素敏感性、摄食量和代谢率,以及棕色脂肪产热和脂代谢相关基因等的影响。方法:6周龄C57BL/6J小鼠分为常规饲料喂养组(CON),高脂饲料喂养组(HFD)和高脂饲料喂养联合GLP-1受体激动剂exendin-4皮下干预组(HFD+EX),每隔2-4周采用Echo MRI-100仪器进行磁共振(MRI)分析,通过全身扫描计算各种小鼠体脂含量和瘦体质含量结果。16周后口服葡萄糖糖耐量试验检测各组小鼠血糖和胰岛素耐量试验,随后采用开放式Oxymax间接测热系统采集并分析HFD和HFD+EX组小鼠摄食量相关指标、自主活动、能量消耗、呼吸商。各组小鼠棕色组织切片行HE染色观察肩胛区棕色脂肪细胞形态并比较棕色细胞大小,real-time PCR和western blot检测肩胛区棕色脂肪能量代谢(UCP-1和PGC-1α)和脂代谢(GLUT4、PPARy2、perilipin)相关mRNA和蛋白表达水平。结果:随着喂养时间的延长,HFD组体重和体脂含量高于CON组,而HFD+EX组则明显低于HFD组(P0.05);葡萄糖耐量试验结果显示,HFD组与CON组小鼠相比糖耐量减低,而 HFD+EX 组明显改善(0-30-60-90-120min: CON 组:91±4-359±50-345±35-260±40-169±33mg/dlvs.HFD 组:122±17-430±55-490±38-453±76-228±47mg/dl vs.HFD+EX 组 116±16-373±49-391±55-326±57-182±34 mg/dl)(P0.05)。胰岛素耐量试验结果显示,HFD组血糖较CON组明显升高,而HFD+EX组较HFD组血糖下降(CON:119±11-68±17-84±8-91±8-101±11mg/dlvs.HFD:134±8-113±17-102±6-115±5-120±4mg/dlvs.HFD+EX: 123±11-93±12-89±27-96±19-106±13 mg/dl) (P0.05);间接代谢测定显示,HFD和HFD+EX组摄食相关指标摄食量、活动量无明显差异(P0.05)。但是产热量HFD+EX组高于HFD组,呼吸商低于HFD+EX组(P0.05); HE染色结果显示,与正常饲养喂养组相比,高脂喂养组肩胛棕色脂肪细胞面积明显增大(3011.8±566.3 vs 711.3±247.1μm2),而exendin-4干预组脂肪细胞面积较高脂组明显减少(956.8±350.1μm2)(P0.05);棕色脂肪组织基因和蛋白分析结果显示,与正常饲料喂养组相比,高脂喂养组产热和脂肪代谢关键的基因表达下降;与高脂喂养组相比,exendin-4干预组产热和脂肪代谢基因表达均显著升高(P0.05)。结论:GLP-1受体激动剂exendin-4能减轻高脂喂养的C57BL/6J小鼠体重、体脂含量,且能明显改善高脂饮食引起的糖耐量异常和胰岛素敏感性下降,改善脂代谢。exendin-4能增加高脂喂养的C57BL/6J小鼠的产热,增加棕色脂肪与产热和脂代谢相关的基因和蛋白表达。这些结果表明,GLP-1受体激动剂可能通过增强棕色脂肪功能,增加产热而发挥减重作用。第三部分GLP-1受体激动剂exendin-4通过拮抗CB1受体增强棕色脂肪细胞功能目的:本部分实验利用体外培养的棕色脂肪细胞,旨在研究GLP-1受体激动剂exendin-4是否通过拮抗CB1受体从而影响棕色脂肪细胞功能,并观察其下游信号通路。方法:体外培养小鼠棕色脂肪细胞,采用real-time PCR检测不同浓度GLP-1受体激动剂exendin-4和GLP-1受体拮抗剂exendin(9-39)干预棕色脂肪细胞CB1的表达;以及检测GLP-1受体激动剂exendin-4和CB1受体激动剂WIN55干预后棕色脂肪细胞产热相关基因UCP-1、PGC-1α和成脂基因PPARγ2表达。Seahorse细胞能量代谢实时检测GLP-1受体激动剂exendin-4和CB1受体激动剂WIN55干预后棕色脂肪细胞能量变化。Westernblot检测GLP-1受体激动剂exendin-4和CB1受体激动剂WIN55干预后棕色脂肪细胞信号通道蛋白AMPK表达水平。结果:GLP-1受体激动剂exendin-4通过浓度依赖方式减少棕色脂肪细胞CB1的表达,而GLP-1受体拮抗剂exendin(9-39)则增加棕色脂肪细胞CB1的表达(P0.05)。CB1受体激动剂WIN55干预组与对照组相比,棕色脂肪细胞产热相关基因UCP-1、PGC-1α和成脂基因PPARγ2表达明显下降,GLP-1受体激动剂exendin-4干预组较对照组UCP-1、PGC-1α和PPARy2的表达明显升高(P0.05),而exendin-4联合WIN55共同干预组UCP-1、PGC-1α和PPARγ2的表达却较exendin-4干预组明显下降(P0.05)。Seahorse细胞能量代谢结果发现与对照组相比,exendin-4干预组棕色脂肪细胞最大呼吸强度明显增加(P0.05), WIN55干预组后棕色脂肪细胞细胞最大呼吸强度较对照组降低(P0.05)。而exendin-4联合WIN55共同干预后棕色脂肪细胞最大呼吸强度较单独exendin-4干预组下降(P0.05)。蛋白分析结果显示,与对照组相比,exendin-4干预组棕色脂肪细胞蛋白pAMPK表达增加;WIN55干预组棕色脂肪细胞蛋白pAMPK表达较对照组降低。而exendin-4联合WIN55共同干预后棕色脂肪细胞pAMPK表达较单独exendin-4干预组降低(P0.05)。结论:Exendin-4可能通过拮抗棕色脂肪细胞CB1受体进而影响其下游相关产热以及脂代谢基因的表达,并且可能通过激活AMPK信号途径而发挥作用。本研究进一步明确了 GLP-1受体激动剂促进棕色脂肪功能增强的具体机制,并为治疗肥胖开辟了新思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R589.2

【参考文献】