糖尿病中补体活化对间充质干细胞存活的影响及机制研究

发布时间：2019-04-02 08:34

【摘要】：研究背景糖尿病是以慢性高血糖为主要特征的终身性、代谢性疾病,其发病可能与遗传、环境及免疫失衡有关。当前,全球糖尿病患病人数超过4.2亿,发病率超过8.5%,且呈逐年上升的趋势,已经成为非常棘手的公共卫生问题。中国的糖尿病发病率高于全球平均水平,目前糖尿病患者人数约占全球患者总量的四分之一,严重威胁着我国国民的健康和我国经济社会的发展。糖尿病本身并不可怕,其种类高达百种以上、可累及全身的并发症才是造成患者身体损害的最直接原因。因此,各种并发症的防治是糖尿病治疗和管理的最重要和最终极目标。然而,由于糖尿病并发症的发病机制尚未完全阐明,使得目前的干预和治疗措施,包括公认最有效的强化血糖控制,均不能完全避免并发症的发生,几乎所有的患者最终会出现或轻或重、或多或少的并发症。多个大型临床试验的研究结果显示,强化血糖控制并不能降低大血管并发症的发生率,其中一项研究结论甚至认为,强化血糖控制有可能会增加糖尿病患者心血管事件的发生率;临床实践中也发现,有些患者长期控制血糖在合理稳定的水平,血脂、血压等指标也监测正常,但最终仍发生一种或多种并发症。因此,在糖尿病患者体内,除了已知的高血糖、高血脂等因素外,一定存在其他的异常,促进着糖尿病并发症的发生和发展。因此,想要预防、治疗、甚至逆转糖尿病并发症,单纯依靠血糖管理还远远不够,必须进一步寻找糖尿病机体内的其他异常并阐明其发生机理。糖尿病并发症的本质是患者体内长期存在的高血糖等代谢紊乱及免疫异常引发微血管和大血管的损伤,并累及周围神经、眼底、心、脑、肾、足等,最终导致多种组织器官的结构损伤和/或功能异常,使患者出现自觉症状或临床表现。在糖尿病机体内高血糖等代谢异常直接或间接导致靶组织损伤的同时,机体通过多种种子修复细胞进行自我修复和再生;当机体的自我修复机制失代偿时,靶组织和靶器官就会出现明显的结构损伤及功能异常,即发生并发症;若未得到合理有效的治疗,损伤进一步加深或累及更多的靶器官,使得并发症加重或数量增多。因此,在严格控制血糖以减轻其对靶组织的直接或间接性损伤的同时,还应同时给予干预措施以增强机体的修复代偿机制,如此双管齐下,可能是防治并发症的有效途径。糖尿病相关性组织损伤可累及全身,而具有强效再生修复功能的间充质干细胞(MSC)也具有全身性广泛分布;另外,糖尿病患者体内存在免疫异常,可能会攻击自身组织结构,而MSC具有直接及间接的免疫调节功能,可能能对抗这种自我攻击;MSC已经被临床用于多种糖尿病并发症的治疗,并显示了很好的疗效。毋庸置疑,MSC是糖尿病相关性损伤时,机体最重要的修复细胞之一。MSC的修复效能取决于其“质”和“量”。在糖尿病机体中,MSCs“质”的受损及机制已被很多研究证实,为大家所公认。但是,关于其“量”的变化,我们却知之甚少。虽然有动物实验发现糖尿病大鼠骨髓细胞中MSC的数量相对减少,但是目前无临床的证据,也缺乏相关的机制研究。另外,在靶组织和靶器官遭受糖尿病相关性攻击和损害时,发挥修复和再生效应的MSC主要直接招募自外周循环;因此,外周循环中MSC的丰度可能是影响机体自我修复效能的重要因素。我们推测,糖尿病患者外周循环中MSC的数量相对缺乏。如果是这样的话,其具体机制是什么呢?研究目的本研究旨在明确糖尿病微环境对MSC自我更新(增殖)和存活的影响,并初步探讨其具体分子机制,以期解释糖尿病患者体内MSC数量相对缺乏的原因。另外,通过对分子机制的探讨,并评价靶向干预手段对于MSC在糖尿病条件下存活的影响,为糖尿病及其并发症的治疗提供新的思路和理论依据。研究方法1.利用特异性抗体标记及流式细胞术(FCM),检测糖尿病患者及健康对照者外周循环中MSC-like(CD34~-/CD105~+)细胞的相对数量,并将检测结果与患者的部分临床资料进行相关性分析;2.利用Lepr~(db/db)糖尿病小鼠及同窝出生的非糖尿病对照小鼠,对来自人群的检测结果加以验证;3.用糖尿病患者的血清(DS)和非糖尿病对照者的血清(NDS)分别模拟糖尿病微环境和非糖尿病微环境,用于体外相关实验;4.分别培养人脐带来源MSC(hUC-MSC)和小鼠骨髓来源MSC(mBM-MSC),利用细胞表面标志物检测及多向诱导分化技术对扩增纯化的MSC进行鉴定;5.利用以下多种技术手段分别评价MSC在不同血清、不同葡萄糖浓度、不同预处理等条件下的生长及存活情况:i.利用MTT法评价MSC在不同处理条件下,某一终点时刻的相对细胞活性ii.利用实时细胞分析(RTCA)技术对MSC在不通过处理条件下的生长及贴壁情况进行实时动态检测和评估iii.利用FCM检测分析不同处理条件对MSC细胞周期的影响iv.分别利用以下方法分析不同处理条件对MSC凋亡的影响a)Hoechst 33258染色b)Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒联合FCM检测c)TUNEL凋亡试剂盒法v.利用蛋白免疫印迹技术检测不同处理条件下,MSC中凋亡相关蛋白的表达变化。6.血清补体水平的检测i.CH50法检测总补体活性ii.免疫比浊法检测血清中C3和C4的含量iii.ELISA试剂盒检测血清中sC5b-9和C5a的含量7.补体效应的阻断或增强方法i.56℃加热处理30分钟,消除血清的补体活性ii.用重组CD59蛋白预孵育MSC,以阻断血清补体对MSC的溶破效应iii.用anti-C5a中和抗体孵育血清以阻断血清中C5a的效应;往NDS或热灭活的DS(HI-DS)中添加重组C5a以增强或恢复C5a的效应iv.用C5a受体(CD88)的拮抗剂PMX-53预孵育MSC,阻断C5a对MSC表面CD88的活化8.MSC表面CD88的表达分析:i.反转录PCR技术检测MSC中CD88 mRNA的表达ii.免疫印迹技术检测MSC中CD88蛋白的表达iii.细胞免疫荧光技术进一步检测CD88蛋白的表达及定位分析9.动物体内实验:i.用CD-DiI染料将mBM-MSC进行荧光标记后,经尾静脉注射移植入Lepr~(db/db)糖尿病小鼠或同窝出生的非糖尿病对照小鼠体内。24小时后,FCM检测小鼠外周血有核细胞中CD-DiI阳性标记细胞的比例ii.将CD-DiI染料标记后的mBM-MSC经腹腔注射移植入Lepr~(db/db)小鼠或对照小鼠体内,同时,Lepr~(db/db)小鼠经腹腔注射CD88拮抗剂PMX-53或PBS。48或72小时后,收集腹腔灌洗液中的细胞,并进行Annexin V-FITC染色,然后FCM检测CD-DiI阳性标记细胞中Annexin V-FITC阳性细胞的比例iii.培养CD88-/-小鼠骨髓来源的MSC(CD88-/-mBM-MSC),进行CD-DiI标记后,将腹腔注射移植入Lepr~(db/db)小鼠或对照小鼠体内。72小时后,按上述方法对植入细胞的凋亡情况进行分析研究结果1.与非糖尿病个体相比,糖尿病个体外周循环中MSC-like细胞的数量明显减少;而且,糖尿病患者并发症的种类/个数与其循环MSC-like细胞的数量呈显著的负相关关系;2.与NDS相比,DS显著降低MSC的相对活性,抑制其细胞周期进程并诱导其发生明显的凋亡;3.高糖培养条件可促进MSC的增殖而几乎不影响其存活;DS对MSC的促凋亡效应也与DS中所含的相对高浓度的葡萄糖无关;4.与NDS相比,DS的总补体活性及多种补体成分的水平均明显升高;人体外周循环中MSC-like细胞的数量与其血清补体的水平呈负相关关系,且这一负相关关系在糖尿病患者中更显著;5.热灭活操作可大幅降低DS对MSC细胞活性、增殖及存活的抑制效应;HI-DS和HI-NDS对MSC的效应/影响相当;6.阻断补体的溶破效应可改善MSC在DS条件下的存活,但作用有限;阻断C5a/C5aR可大幅改善MSC在人血清(尤其是DS)条件下的存活;额外添加C5a会增强/恢复NDS或HI-DS对MSC的促凋亡效应;7.MSC细胞表面阳性表达CD88,且在DS条件下会发生表达上调;8.CD88-/-mBM-MSC在NDS和DS条件下的凋亡情况相当;在DS条件下,与WT mBM-MSC相比,CD88-/-mBM-MSC中促凋亡相关蛋白的表达水平相对较低,而抗凋亡的Bcl-2表达相对较高;9.阻断或增强补体效应的操作可显著影响hUC-MSC被血清处理后凋亡相关蛋白的表达水平;10.靶向阻断C5a/C5aR通路可以显著降低mBM-MSC在Lepr~(db/db)小鼠体内的凋亡发生率。研究结论基于本研究的研究结果,我们认为,糖尿病患者外周循环中的MSC相对缺乏,使得受损的靶组织不能募集到足够数量的MSC来发挥自我修复效应,最终导致了并发症的发生发展。糖尿病微环境不利于MSC的自我更新和存活,会诱导MSC发生凋亡性死亡,这可能是糖尿病患者循环MSC数量相对缺乏的重要原因之一。糖尿病微环境对MSC的促凋亡效应与其所含的高糖因素无关,而主要是通过异常活化的补体系统来实现,其中又以C5a引发的生物学效应最为关键。靶向阻断C5a/C5aR通路可以明显改善MSC在体外及体内糖尿病微环境条件下的存活,可能是一种提高循环MSC丰度的有效途径。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2

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