负载myostatin-propeptide的Exosome在杜兴肌肉萎缩症上的功能研究

发布时间：2019-04-28 15:39

【摘要】：目的:杜兴肌肉萎缩症(Duchenne Muscular Dystrophy-DMD)是一种罕见遗传性疾病,是由编码dystrophin蛋白的DMD基因突变导致功能性dystrophin蛋白缺失而引起。该疾病在新生男孩中的发病率为1/3500,主要表现为进行性肌肉萎缩,疾病发展后期出现心肌肥大、呼吸衰竭等症状,最终导致病人死亡。目前临床上尚无有效的治疗DMD的方法,对DMD治疗研究主要集中于缓解DMD病人肌肉萎缩症状及恢复功能性dystrophin蛋白表达,其中以肌肉生长抑制因子(myostatin)为主要作用靶点的辅助治疗研究受到广泛关注。其作用机制是通过其前体短肽myostatin-propeptide抑制myostatin的活性,解除myostatin对肌肉的负性调控作用,促进肌肉再生分化,达到缓解DMD所引起的肌肉萎缩的目的。众所周知,短肽在血液中极不稳定,半衰期较短,而本课题组前期研究发现,哺乳类细胞分泌的一种纳米级囊泡结构-外泌体(exosome),可作为蛋白和核酸药物的运输载体,并对核酸起到一定保护作用。因此,在本研究中,我们拟利用杜兴肌肉萎缩症小鼠模型(mdx小鼠),系统研究exosome作为propeptide短肽运输载体的可行性和应用潜力,通过检测负载propeptide短肽的exosome对DMD肌肉的改善作用,以期为DMD治疗提供一种新型药物运输载体和治疗手段。方法:利用RT-PCR获取小鼠myostatin propeptide基因序列,构建CD63-propeptide(CD63-Pro)融合表达质粒。利用慢病毒感染小鼠NIH3T3细胞系,获得稳定表达CD63-Pro融合短肽的细胞系。通过超速离心和超滤法收集CD63-Prop融合表达细胞分泌的外泌体(EXOmyo-pro),利用Western Blot检测确认稳定表达细胞系及其分泌外泌体中propeptide的表达水平。为确定EXOmyo-pro与血清中myostatin的结合能力,将EXO或EXOmyo-pro以10mg/kg剂量通过尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内,在循环24h后,收集血清,离心去除血清中外泌体,再利用Western Blot检测血清中myostatin表达。分别在细胞模型、CTX损伤的C57BL/6急性损伤和dystrophin蛋白缺失的mdx小鼠模型上,系统测试不同剂量EXOmyo-pro对肌肉细胞、急性和慢性肌肉损伤的再生修复作用。利用HE染色检测损伤组织形态及肌纤维面积、IHC检测胚胎肌球重链(e My HC)表达以评估修复效果;Western Blot检测分化相关标志蛋白Myo D、Myo G表达以确定EXOmyo-pro对肌肉分化的影响。除此之外,在mdx小鼠上系统测试EXOmyo-pro反复给药对mdx小鼠体重、抓力、肌肉重量及肌纤维面积等的改善情况以确定其作用效果。结果:成功构建CD63-Pro融合表达的NIH3T3细胞系,并证明融合表达细胞及其分泌的exosomes中表达propeptide。与血清中myostatin的结合试验表明:EXOmyo-pro能够显著降低小鼠血清中myostatin表达,说明EXOmyo-pro能够与血清中的myostatin高效结合。体外细胞试验结果显示,EXOmyo-pro处理组较对照组Myo G表达升高,说明EXOmyo-pro能够抑制myostatin活性,从而促进细胞分化。在C57BL/6局部肌肉急性损伤模型上的测试结果显示,与对照组相比,EXOmyo-pro处理组肌肉重量增加、肌纤维面积增大、e My HC表达增加,说明EXOmyo-pro能够增强急性损伤后的肌肉再生修复能力。在mdx小鼠上的不同剂量测试表明,与10mg/kg三次注射相比,20mg/kg三次注射能够显著提高mdx小鼠肌肉功能及肌纤维分化再生能力。在mdx小鼠上按20mg/kg的剂量重复注射的结果表明:与单次注射相比,多次重复注射能够显著增加mdx小鼠体重、肌肉重量及抓力;EXOmyo-pro处理组Myo D、Myo G表达明显升高,说明EXOmyo-pro对mdx小鼠肌肉再生、分化及增殖具有累积作用。与3次重复注射相比,5次EXOmyo-pro连续注射对mdx小鼠肌肉增殖、分化等具有显著增强效果。结论:我们的研究结果表明:exosome可作为myostatin--propeptide的运输载体能够与血清中myostatin高效结合并抑制myostatin活性,从而促进损伤肌肉的再生、增殖和分化,改善mdx小鼠肌肉状态,为propeptide介导的DMD辅助治疗提供一种新型运输载体系统。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R596

【参考文献】