【摘要】：第一部分糖尿病患者循环纤维细胞的分离、培养及鉴定目的：探讨糖尿病患者外周血液循环纤维细胞(circulating fibrocytes, cFb)的分离、培养方法,为后继开展烧伤患者cFb生物学活性研究探索条件。方法：采用密度梯度离心法分离烧伤患者外周血液单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs),接种于含20%胎牛血清的高糖DMEM培养液中,连续培养28天。每次更换细胞培养液时,除给予PBS漂洗之外,不作任何特殊处理。细胞分离、接种后当天、第3、5-6、7-8、14、17、21、24、28天于倒置相差显微镜下观察细胞增殖及形态变化,并通过数码相机采集图片。实时荧光定量PCR方法检测分离培养14、28天的贴壁细胞表达细胞外基质蛋白Co1-Iα、α-SMA、生长因子TGF-β1、bFGF能力,从而对其进行功能鉴定。结果：1)形态上,由糖尿病患者外周血分离得到的外周血单个核细胞呈圆球形。分离、培养2～3天,绝大多数PBMCs仍呈散在圆球形、悬浮,但可见部分散在的细胞集落形成,其边缘可有少量梭形贴壁细胞。至培养第4天,细胞集落现象更为明显,梭形细胞数量增加。随着时间的延长,大约在培养第5-7天,细胞集落逐渐减少,到第10天,细胞集落基本完全消失,取而代之的是梭形细胞增殖,呈现典型的梭形成纤维细胞样外观,且排列规律。分离后第14天,梭形细胞密度增大,呈典型梭形,且规则排列。分离后第21天,细胞增殖旺盛,呈典型梭形,且规则排列。分离后第28天,可见细胞数量扩增,呈典型梭形,且规则排列；2)体外培养28天的糖尿病患者cFb表达Co1-Iα和a-SMAmRNA的表达能力增强,其中,Col-Iα mRNA的表达量相对于14天达到72716.74倍(P0.05),而a-SMAmRNA的表达量相对于14天仍呈上升趋势,为2.38倍,但差异无统计学意义(P0.05)；3)体外培养28天的糖尿病患者cFb与体外培养14天的糖尿病患者cFb相比,培养28天的cFb表达TGF-β1 mRNA的表达能力呈下降趋势,但差异无统计学意义(P0.05),而bFGF mRNA的相对表达量却明显提高,达前者的5.98倍(P0.05)。结论：通过密度梯度离心-贴壁培养的方法,可从糖尿病患者外周血液成功分离具有典型梭形外观、高表达间质细胞标志Co1-Iα和α-SMAmRNA的cFb。第二部分糖尿病对外周血液循环纤维细胞表达细胞因子活性的影响目的：通过糖尿病患者与正常人外周血液循环纤维细胞(circulating fibrocytes, cFb)的对比研究,观察两者合成细胞外基质Co1-Iα、α-SMA、趋化因子MIP-1α趋化因子受体CCR5、CXCR4.炎症介质TNF-α、IL-6、生长因子TGF-β1、bFGF mRNA的能力,旨在了解糖尿病对cFb以表达细胞因子的能力为代表的生物学活性的影响,为进一步的临床应用研究提供依据。方法：采用密度梯度离心法分离糖尿病患者和健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs),接种于含20%胎牛血清的高糖DMEM培养液中,连续培养28天。每次更换细胞培养液时,除了给予PBS漂洗之外,不作任何处理。并于分离培养14天、28天对其分离成功率、cFb获得率及增殖活性进行观察。以实时定量PCR检测培养14、28天的cFb表达细胞外基质Co1-Iα、α-SMA、趋化因子MIP-1α、趋化因子受体CCR5、CXCR4、炎症介质TNF-α、 IL-6、生长因子TGF-β1、bFGF mRNA的能力,并比较糖尿病患者与正常人cFb在上述时间点表达相关因子mRNA的能力。结果：1)在外周血液cFb分离培养过程中,45份正常人肝素抗凝血标本和47份糖尿病患者肝素抗凝血标本纳入本研究进行体外分离培养。结果显示：正常组PBMCs成功分离43份(95%),获得cFb的有25份(55%)：而糖尿病组PBMCs成功分离43份(91%),获得cFb的有15份(32%)。对分离后获得贴壁梭形细胞的样品进行体外增殖活性的观察,结果显示正常人cFb体外培养5至7天细胞融合率可达到约50%,而糖尿病患者cFb的增殖则显著延迟,需要在体外培养10至14天细胞融合率才能达到约50%。2)体外培养14天的糖尿病患者cFb,细胞外基质Co1-Iα、趋化因子MIP-1α、生长因子bFGFmRNA的相对表达量均高于正常人cFb在相同时间点的表达量,存在显著差异(P0.05)；而细胞外基质α-SMA、趋化因子受体CXCR4、炎症介质IL-6、生长因子TGF-β1 mRNA相对表达量均低于正常人cFb在相同时间点的表达量,但差异无统计学意义(P0.05)；趋化因子受体CCR5、炎症介质TNF-amRNA相对表达量与正常人cFb在相同时间点的表达量相似,但差异无统计学意义(P0.05)。3)体外培养28天的糖尿病患者cFb,细胞外基质Co1-Iα、生长因子bFGFmRNA的相对表达量均高于正常人cFb在相同时间点的表达量,有显著差异(P0.05)；而趋化因子MIP-1α、趋化因子受体CXCR4、炎症介质IL-6mRNA相对表达量均低于正常人cFb在相同时间点的表达量,存在显著差(P0.05)；细胞外基质α-SMA.趋化因子受体CCR5、炎症介质TNF-α、生长因子TGF-β1 mRNA相对表达量均低于正常人cFb在相同时间点的表达量。但差异无统计学意义(P0.05)。结论：1)糖尿病患者外周血液来源的cFb在成功率、获得率、增殖活性等方面均低于正常对照组。2)体外培养14天及28天的糖尿病患者cFb表达细胞外基质α-SMA、炎症介质、生长因子TGF-β1 mRNA的能力均低于正常人cFb,提示糖尿病状态可抑制外周血cFb表达与创伤修复相关因子的能力,影响其在糖尿病等慢性创面修复中的临床应用价值。3)体外培养14天及28天的糖尿病患者cFb表达细胞外基质Co1-Iα生长因子bFGFmRNA的能力强于正常人cFb,提示糖尿病状态下cFb在细胞外基质的合成、以及新生血管形成调节因子mRNA表达水平方面有所增强,对糖尿病慢性创面愈合可能具有促进作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1
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本文编号：2476228
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