高糖对小鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及机制

发布时间：2019-05-24 02:48

【摘要】：目的本文拟探讨miR-32在高糖介导的VSMCs钙化中的作用及机制,为阐明糖尿病血管钙化的发病机制提供实验依据。方法1.为检测高糖对血管平滑肌细胞钙化的影响,以正常浓度葡萄糖(NG,5 mM)或高浓度葡萄糖(HG,25 mM)处理小鼠血管平滑肌细胞(MVSMCs),不加或者加钙化培养基诱导钙化,1天和3天后通过qRT-PCR和/或Western Blot检测平滑肌标志物(SMA、SM-22和SM-MHC)、成骨标志物(OCN、ALP和RUNX2)的表达水平,以及应用分光光度法检测ALP活性。30天后应用茜素红染色检测MVSMCs钙含量。2.为了检测miR-32是否参与MVSMCs钙化过程的调控,将pre-miR-32、anti-miR-32分别转染入MVSMCs中,通过qRT-PCR检测OCN、BMP-2、Runx2、OPN以及MGP的mRNA表达水平,应用分光光度法检测ALP活性,并测定钙含量。3.MVSMCs分别在含5mmol/l及25mmol/l糖浓度的培养基中培养,不加或者加钙化培养基诱导钙化,1天和3天后通过qRT-PCR和/或Western Blot检测miR-32、靶基因GATA6以及GATA6下游基因Grem1的表达水平;同时,应用荧光素酶实验检测GATA6对OCN启动子活性的影响。结果1.高糖对平滑肌细胞钙化的影响:高糖诱导了MVSMCs钙含量的增多,显著增加了MVSMCs的成骨标志物(ALP、OCN和RUNX2)的表达。此外,高糖降低了平滑肌标志物(SMA、SM-22和SM-MHC)的表达水平。2.miR-32对平滑肌细胞钙化的影响:pre-miR-32转染入MVSMCs4天后,MVSMCs的BMP2、Runx2、OPN和MGP的mRNA水平明显增加;过表达miR-32导致MVSMCs的ALP活性显著增强,以及MVSMCs钙含量的明显增加。而将anti-miR-32转染入MVSMCs后,上述结果刚好相反。3.高糖诱导平滑肌细胞钙化的可能机制:高糖显著增加了MVSMCs的miR-32表达水平,相应地降低了miR-32的靶基因—GATA6的mRNA和蛋白水平;我们还发现了高糖可降低Grem-1的表达;荧光素酶实验则显示GATA6可抑制OCN启动子活性。结论1.高糖可促进小鼠血管平滑肌细胞钙化。2.miR-32可在血管钙化过程中发挥调控作用,能促进平滑肌细胞的钙化。3.高糖可通过诱导miR-32上调降低GATA6的表达,并影响sm-MHC/OCN/Grem1信号网络促进平滑肌细胞钙化的发生。
[Abstract]:Objective to investigate the role and mechanism of miR-32 in high glucose mediated VSMCs calcification, and to provide experimental basis for the pathogenesis of diabetic vascular calcification. Method 1. In order to detect the effect of high glucose on calcification of vascular smooth muscle cells (VSMCs), mouse vascular smooth muscle cells (VSMCs) were treated with normal concentration of glucose (NG,5 mM) or high concentration of glucose (HG,25 mM) without adding or adding calcification medium to induce calcification. The expression of smooth muscle markers (SMA,SM-22 and SM-MHC) and osteogenic markers (OCN,ALP and RUNX2) were detected by qRT-PCR and / or Western Blot 1 and 3 days later. And the activity of ALP was detected by spectrophotometry. 30 days later, the calcium content of MVSMCs was detected by alizalin red staining. In order to detect whether miR-32 was involved in the regulation of MVSMCs calcification, pre-miR-32,anti-miR-32 was transfected into MVSMCs, and the mRNA expression levels of OCN,BMP-2,Runx2,OPN and MGP were detected by qRT-PCR. The activity of ALP was detected by spectrophotometry, and the calcium content was determined. 3. MVSMCs were cultured in the medium containing 5mmol/l and 25mmol/l sugar concentration, and calcification was induced by adding or adding calcification medium, respectively. One day and three days later, the expression levels of miR-32, target gene GATA6 and GATA6 downstream gene Grem1 were detected by qRT-PCR and / or Western Blot. At the same time, the effect of GATA6 on the activity of OCN promoter was detected by luciferase assay. Result 1. Effect of high glucose on calcification of smooth muscle cells: high glucose induced the increase of MVSMCs calcium content and significantly increased the expression of osteogenic markers (ALP,OCN and RUNX2) of MVSMCs. In addition, high glucose decreased the expression of smooth muscle markers (SMA,SM-22 and SM-MHC). Effect of miR-32 on calcification of smooth muscle cells: after pre-miR-32 transfer into MVSMCs4, MVSMCs BMP2,Runx2, The mRNA levels of OPN and MGP increased significantly. Overexpression of miR-32 resulted in a significant increase in ALP activity and MVSMCs calcium content in MVSMCs. After anti-miR-32 was transferred into MVSMCs, the above results were just the opposite. The possible mechanism of calcification induced by high glucose in smooth muscle cells: high glucose significantly increased the expression of miR-32 in MVSMCs and decreased the mRNA and protein levels of GATA6, the target gene of miR-32, and we also found that high glucose could decrease the expression of Grem-1. Luciferase assay showed that GATA6 could inhibit the activity of OCN promoter. Conclusion 1. High glucose can promote calcification of vascular smooth muscle cells in mice. 2.miR-32 can play a regulatory role in the process of vascular calcification and promote calcification of smooth muscle cells. High glucose can up-regulate the expression of GATA6 by inducing miR-32, and affect the sm-MHC/OCN/Grem1 signal network to promote the calcification of smooth muscle cells.
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 陆峥飞;;胰岛素减轻血管平滑肌细胞钙化但增加血管平滑肌细胞的磷转运[J];生理科学进展;2007年04期

2 信栓力;吴宗贵;;壳糖体外介导血管平滑肌细胞内皮型一氧化氮合酶基因转移的初步研究[J];上海医学;2007年10期

3 盛晓峗;王树人;;血管平滑肌细胞移行及表型转换的分子机制[J];中国动脉硬化杂志;2008年11期

4 梁明达;邱殷庆;;人血管平滑肌细胞系的建立及其特性[J];云南医药;1988年03期

5 高钰琪,孙秉庸;血管平滑肌细胞的钙动力学[J];生理科学进展;1990年04期

6 张茜;血管紧张素Ⅱ受体与血管平滑肌细胞的增生、肥大[J];高血压杂志;1997年01期

7 谢良地，，吴可贵，陈达光，Ａ．Ｄ．Ｈｕｇｈｅｓ,Ｚ．Ｃｌｕｎｎ,Ｊ．Ｌｙｍｎ;血小板源生长因子诱导血管平滑肌细胞迁移及机构[J];中国动脉硬化杂志;1998年01期

8 卢次勇,凌文华,马静,吴聪娥;氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞应激活化蛋白激酶活性及凋亡的影响[J];华南预防医学;2002年04期

9 季宁东;血管平滑肌细胞的增殖机制[J];中国基层医药;2002年03期

10 聂胜利,冉丕鑫,陈颜芳,陈顺存;碱性成纤维细胞生长因子对肺血管和肺血管平滑肌细胞的作用[J];广州医学院学报;2003年04期

相关会议论文 前10条

1 童中艺;王佐;傅仕福;危当恒;姚峰;吕运成;喻丹凤;王贵学;;氧化型低密度脂蛋白对大鼠血管平滑肌细胞基质细胞衍生因子1α表达的影响[A];第八次全国动脉硬化性疾病学术会议论文集[C];2005年

2 刘建平;唐波;何国祥;;直流电场影响血管平滑肌细胞迁移和增殖的实验研究[A];中华医学会心血管病学分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2006年

3 王宁宁;王笑云;何东元;熊明霞;张飞飞;杨俊伟;;体外高磷诱导人血管平滑肌细胞钙化的作用研究[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年

4 赵瑾;迟路湘;诸兴明;;兔颈动脉粥样硬化斑块形成过程中血管平滑肌细胞功能变化的动态观察[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年

5 余惠珍;谢良地;朱鹏立;;人组织激肽释放酶基因转移对血管平滑肌细胞迁移的影响[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年

6 唐波;何国祥;刘建平;李德;;血管平滑肌细胞受电场作用后迁移的变化[A];中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2004年

7 刘建平;何国祥;唐波;景涛;;电场干预对血管平滑肌细胞表面血小板衍化生长因子受体分布的影响[A];中华医学会心血管病学分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2006年

8 唐波;何国祥;刘建平;李德;;电场干预对血管平滑肌细胞形态和细胞骨架的影响[A];中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2004年

9 唐波;刘建平;何国祥;李德;;直流电场对大鼠血管平滑肌细胞骨架分布的作用[A];中华医学会心血管病学分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2006年

10 唐波;刘建平;何国祥;李德;;直流电场对血管平滑肌细胞迁移的影响[A];中华医学会心血管病学分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2006年

相关重要报纸文章 前2条

1 张诚;选择有挑战性的研究课题[N];科技日报;2005年

2 余宁宁;冠心病病因迷雾拨开[N];健康报;2004年

相关博士学位论文 前10条

1 宋海波;（一）ROS调节大鼠血管中膜干细胞向血管平滑肌细胞分化机制的研究 （二）Iriain通过ERK信号通路促进人脐静脉内皮细胞的增殖并部分抑制高糖诱导的凋亡[D];山东大学;2015年

2 陈齐山;microRNA-34a调控血管平滑肌细胞表型转化在血管损伤修复及重塑中的作用及机制[D];浙江大学;2015年

3 万雪娇;BK通道在张应变诱导血管平滑肌细胞分化中的作用及其机制[D];上海交通大学;2015年

4 丁雪燕;OCT4对血管平滑肌细胞增殖迁移及血管新生内膜增生的作用及机制[D];第二军医大学;2016年

5 武卫东;大鼠血管平滑肌细胞蛋白组学的研究以及尼古丁对血管平滑肌细胞蛋白和基因表达影响的研究[D];山西医科大学;2005年

6 马晶;β-肾上腺素能受体不同亚型对于血管平滑肌细胞迁移、凋亡及增殖的影响及其信号转导机制[D];中国人民解放军军医进修学院;2004年

7 朱清;肾素-血管紧张素系统及其阻断剂对血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化中的作用机理的研究[D];山东大学;2003年

8 郭家龙;靶向沉默MT1-MMP基因对血管平滑肌细胞迁移能力的影响[D];华中科技大学;2009年

9 冯健;齐墩果酸对大鼠血管平滑肌细胞中血红素氧合酶1表达的影响及其作用机制的研究[D];第三军医大学;2011年

10 万方;骨保护素对血管平滑肌细胞的保护性作用及其机制研究[D];中南大学;2011年

相关硕士学位论文 前10条

1 冯模强;OPG与冠状动脉粥样硬化相关性及其对人血管平滑肌细胞钙化的影响[D];川北医学院;2015年

2 张睦清;维生素K2对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响和机制[D];河北医科大学;2015年

3 成龙;水蛭酶解提取物抑制脂多糖诱导的大鼠血管平滑肌细胞ICAM-1、VCAM-1及MCP-1的表达[D];山东大学;2015年

4 匡陈伟;大鼠血管平滑肌细胞表型转化前后NCX1表达变化的研究[D];昆明医科大学;2015年

5 李梅;RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞Ca_v1.2、Ca_v1.3基因表达的影响[D];山西大学;2015年

6 陈天雷;Klotho蛋白对血管平滑肌细胞钙化的影响及其机制研究[D];南京医科大学;2015年

7 张苗;失活氨基脲敏感性胺氧化酶对动脉粥样硬化发展的影响[D];苏州大学;2016年

8 侯梦琳;姜黄素抑制大鼠血管平滑肌细胞钙化的凋亡信号机制研究[D];中山大学;2016年

9 龚海燕;高糖对小鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及机制[D];南华大学;2016年

10 欧林灵;miR-32-5p在小鼠血管平滑肌细胞中对PTEN表达调控的作用及机制研究[D];南华大学;2016年

本文编号：2484477