RNA干扰特异性阻断胰岛局部RAS对胰高血糖素分泌功能的影响及其机制研究

发布时间：2019-06-19 14:25

【摘要】：千百年来,医学不断前进,寻求治疗人类疾病的良方,探寻的脚步从未停歇。改善群众的生活质量、延长生命从来都是医者的崇高使命。随着经济的迅猛发展和工业化的进程,生活方式的转变以及老龄化进程的加速,使得我国糖尿病的发病率正呈急剧上涨的趋势,成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的又一个严重危害群众健康的重要的慢性非传染性疾病。WHO估计2005-2015年间中国因为糖尿病及其相关心血管疾病而致使的经济损失高达5577亿美元。近些年的大量调查表明,不论是欧美发达国家亦是发展中国家,糖尿病的控制状况都不大乐观。长期以来,为抑制糖尿病病魔肆虐,国内外同仁共同为防治糖尿病做着孜孜不倦的努力,开展了大量糖尿病宣传教育、流行病学调查、防治研究、临床以及基础研究。全球范围内不断涌现的新型降糖药物,为防治糖尿病提供了更多的选择。然而,不论是增加胰岛素分泌还是改善胰岛素敏感性,亦或是胰岛素泵替代治疗,大多局限于“胰岛p细胞/胰岛素”这个单一的靶点,尚不能完全纠正糖尿病状态下机体的病理生理紊乱,而且单纯改善血糖控制水平并未带来预期的获益。因此,寻找糖尿病治疗的新靶点,对于糖尿病及其并发症的控制具有重要意义。胰岛α细胞数量占胰岛细胞总量的15%-20%,其分泌的胰高血糖素是由29个氨基酸构成的直链多肽,与胰岛素作用相互拮抗,具备很强的促进糖原分解和糖异生作用。胰高血糖素的分泌在很大程度上取决于胰岛β细胞分泌的胰岛素。正常情况下,餐后血糖升高会刺激β细胞分泌胰岛素,而α细胞则会减少胰高血糖素的分泌；随着血糖及胰岛素水平的下降,胰高血糖素分泌增加而加强对肝糖的输出,从而升高血糖。一般认为,胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能紊乱是T2DM的主要病理生理学机制,而胰高血糖素在其中的作用考虑的很少。近年来,胰岛α细胞上同样被发现存在胰岛素受体及其下游信号通路,并证明胰岛素是经过胰岛素受体底物(I nsulin receptor substrate, IRS)-磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidyl inositol-3-kinase, PI3 K)途径抑制胰岛α细胞胰高血糖素的基因表达和释放。α细胞膜上受体后胰岛素信号转导通路受损,致使胰高血糖素合成和分泌亢进。因此,在糖尿病状态下,胰岛素分泌受损削弱对胰高血糖素分泌的抑制作用或α细胞的胰岛素敏感性下降,胰高血糖素分泌出现不适当上升。近年来,大量证据表明肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)的过度激活参与了T2DM的发展,与此同时,国外一些大规模人群临床研究发现血管紧张素受体阻断剂(Angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockers, ARB)或血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin-converting enzyme inhibitors, ACEI)治疗显著降低了高危人群中新诊断糖尿病的发生率,但其改善糖尿病的确切机制目前尚未完全阐明,可能与改善胰岛素分泌及胰岛素敏感性有关。经典的系统RAS在调节血压、水电质平衡方面发挥关键作用；此外,RAS的所有组分均被证实存在于肾上腺、肝、心脏、脑、神经元、生殖器官、血管、骨骼肌、脂肪及胰岛等许多组织中,即存在局部独立的RAS,在局部的生理病理过程中起着重要的作用。因此,胰岛局部RAS可能影响胰岛功能。实际上,不管在体动物研究还是离体动物研究均表明,RAS可诱导胰岛纤维化、氧化应激以及炎症的形成,并可削弱胰岛素分泌,而RAS拮抗剂或ACEI拮抗剂处理后可改善胰岛结构及功能,并对糖耐量有一定改善。目前,关于胰岛局部RAS的作用多集中于其对胰岛β功能的影响,而胰岛局部RAS对胰岛α细胞功能的研究及其对胰高血糖素分泌改变有何影响?其相关细胞信号转导通路机制如何?尚不清楚,目前国内外相关资料甚少。当前证据表明RAS通过介导胰岛血流减少、胰岛纤维化、氧化应激和炎症等而影响胰岛素分泌以及其敏感性。我们前期研究也发现ARB能显著改善db/db糖尿病小鼠的糖耐量,减轻胰岛素抵抗,并对胰岛p细胞功能具有一定的改善作用,同时观察到胰高血糖素分泌减少,但无法确定这些保护作用是源于胰岛局部RAS阻断还是全身RAS阻断。血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, AT Ⅱ)作为RAS的最主要活性物质,需与靶器官或靶组织上的相应受体即血管紧张素Ⅱ 1型受体(Angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R)结合才能发挥生物学作用。因此,本研究利用db/db小鼠为研究对象,观察其胰岛局部AT1R的表达,通过腺病毒介导RNA干扰(RNAinterference, RNAi)特异性抑制胰岛局部AT1R的表达,观察其对胰岛素相关信号通路分子表达的影响,并利用胰岛灌流评估其胰高血糖素及胰岛素动态分泌功能,探讨其可能的作用机制,进而揭示胰岛局部RAS在内分泌胰腺中的作用及与2型糖尿病的关系,为寻找糖尿病防治药物的新作用靶点拓展新思路。具体研究分为以下三个部分：第一章 db/db糖尿病小鼠胰岛局部血管紧张素Ⅱ1型受体的表达[目的]观察db/db小鼠胰岛局部AT1R的表达,以进一步揭示胰岛局部RAS在胰高血糖素分泌功能中的作用。[方法]选取15只8周龄无特定病原体(SPF)级雌性C57BL/KsJ-db/db小鼠及15只同周龄同窝出生的C57BL/KsJ-db/m小鼠。分离培养db/db和db/m小鼠胰岛,荧光实时定量PCR(qRT-PCR) 及 Western blot检测AT1RmRNA和蛋白的表达。[结果]db/db小鼠胰岛AT1R mRNA及蛋白的表达水平均为db/m小鼠胰岛的3倍左右,差异均有统计学意义[mRNA:(320±25)%vs(100±8)%, P0.05;蛋白：(310±20)%vs(100±8)%), P0.05]。[结论]db/db糖尿病小鼠胰岛局部AT1R过度表达。第二章 db/db糖尿病小鼠胰岛局部AT1R基因RNA干扰重组腺病毒的构建[目的]构建AT1R基因靶向RNAi重组腺病毒,并在293包装细胞中扩增制备重组病毒。[方法]由生物公司合成针对db/db小鼠AT1R mRNA的特异性小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)真核表达质粒psiRNA-ATIR;双酶切得到siRNA-AT1R表达片段；插入pAdTrack载体上,获得转移质粒pAdTrack-siRNA-AT1R;后者经线性化处理后,转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组；Pac Ⅰ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-siRNA-AT1R;酶切线性化后转染293细胞包装成重组病毒Ad-siAT1R,荧光显微镜观察绿色荧光表达,行PCR鉴定。通过反复感染扩增病毒,以氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒。同法扩增空载病毒Ad-siControl至相当量,并纯化。[结果]Pac Ⅰ酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAdEasy-siRNA-AT1R构建成功；于荧光显微镜下观察到pAdEasy-siRNA-AT1R转染293细胞后有绿色荧光蛋白表达；PCR鉴定说明重组腺病毒中含siRNA-AT1R片断,成功构建了携带含AT1R干扰RNA的重组腺病毒Ad-siAT1R,在293包装细胞中扩增后,利用氯化铯梯度离心纯化法获得约3.6×109 efu/ml滴度的重组腺病毒。[结论]利用A dEasy-1系统可快速高效制备表达AT1R干扰RNA的重组腺病毒,为进一步研究胰岛局部RAS在胰高血糖素分泌功能中的作用奠定了基础。第三章胰岛灌流评估db/db小鼠胰岛局部AT1R基因沉默后的胰高血糖素动态分泌功能[目的]观察AT1R基因靶向RNAi重组腺病毒对db/db小鼠胰岛中AT1R表达以及IRS、PI3K调节亚基p85[PI3K(p85)]以及磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(p-Akt2)的表达,并利用离体胰岛灌流系统评估胰岛素及胰高血糖素动态分泌情况,探讨其可能的机制。[方法]db/db小鼠胰岛过夜培养,分为3组处理：Ad-siAT1R组,按MOI 100,加入Ad-siAT1R病毒液,作用2小时,更换新培养液；空病毒组：以不表达任何目的基因的腺病毒Ad-siControl用相同的MOI感染；空白对照组：同等条件下培养但未行任何干预处理的胰岛。胰岛继续培养48小时,此后检测/T1R、IRS-1、IRS-2、PI3K(p85)及p-Akt2表达,并利用胰岛灌流评估胰高血糖素及胰岛素动态分泌。[结果]1、与Ad-siControl组相比,Ad-siAT1R组AT1RmRNA和蛋白表达水平显著下降；2. Ad-siAT1R组IRS-1、IRS-2、PI3K(p85)及p-Akt2蛋白表达水平Ad-siControl组均显著上调；3、胰岛灌流显示Ad-siATIR组在高糖刺激1-2min后,胰岛素分泌急剧上升达到高峰140 mU/L,为基础水平的2.8倍,而其胰高血糖素分泌立即出现显著性下降,达14pmol/L,与基础值相比,下降13pmol/L;而Ad-siControl组在高糖刺激1-2min时胰岛素分泌也出现一定程度的升高,峰值仅为90 mU/L,为基础值的1.8倍,其胰高血糖素分泌逐渐下降至35pmol/L,仅比基础值下降5pmol/L。[结论]RNAi技术特异性抑制胰岛局部RAS显著改善了db/db小鼠胰高血糖素的过度分泌情况,这可能得益于胰岛素分泌增加导致的抑制作用增强,但是否与α细胞胰岛素敏感性相关,有待采用a细胞株进一步研究探明。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1

【共引文献】